os fragmentos que possuam nucleotídeos complementares aos nucleotídeos seletivos (utilizados nos terminais 3' dos iniciadores) serão amplificados. Assim, os alelos dos locos de AFLP (presença ou ausência de um determinado fragmento ou banda) são oriundos da perda ou ganho de um sítio de restrição, ou da complementaridade ou não das bases seletivas usadas nos terminais 3' dos iniciadores aonde se inicia a PCR com a região que flanqueia o sítio de restrição. A amplificação seletiva visa diminuir o número de fragmentos gerados pela digestão, reduzindo artefatos da técnica, principalmente co-migração de fragmentos submetidos à eletroforese. Embora o uso de 1 nucleotídeo seletivo (N) na pré-amplificação e de 3 na amplificação seletiva tenha levado a bons resultados em um grande número de espécies, isto deve ser adequado a cada genoma. Teoricamente, genomas menores possuem menor número de fragmentos, sendo possível uma menor intensidade na amplificação seletiva (Ex.: EcoRI+2N/MseI+3N). Em genomas maiores, pode ser usada maior intensidade na amplificação seletiva (Ex.: EcoRI+3N/MseI+4N). A maior parte destes produtos resultantes da amplificação seletiva apresenta um tamanho variando de 50 a 800 nucleotídeos. Cada base seletiva reduz em ¼ (25%) o número de produtos amplificados. Como são 2 sítios de iniciação da PCR, somente 1 em cada 16 (6,25%) fragmentos serão amplificados. Para separação e identificação dos produtos de amplificação por AFLP, o método mais adequado é a eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante, o qual proporciona um alto nível de resolução, sendo eficiente para detecção de diferenças em um único nucleotídeo (Figura 3). O número de fragmentos visualizados em géis de poliacrilamida varia de algumas dezenas até mais de uma centena. Teoricamente, quanto maior o genoma, maior será o número de fragmentos. Esses géis são usados para leituras manuais ou automatizadas. A leitura manual é realizada após a revelação do padrão de bandas por coloração com nitrato de prata ou revelação em autoradiografias, neste caso usando iniciadores marcados com radioisótopos. A leitura automatizada requer marcação fluorescente, e é realizada por analisadores de DNA (ALFA- Automated Laser Fluorescence Analysis), que são equipamentos de alto custo e que requerem softwares especiais também de elevado preço. A revelação de géis em autoradiografias requer a marcação dos iniciadores com radioisótopos: são usados o [γ 33 P]ATP eo[γ 32 P]ATP. A marcação é feita nos iniciadores dirigidos aos adaptadores das enzimas de corte raro. O uso de radioisótopos requer acomodações apropriadas nos laboratórios, licença do CNEN (Comissão Nacional de Energia Nuclear), treinamento em proteção radiológica, equipamentos de segurança específicos (escudo de proteção para manuseio, recipientes para armazenamento do material radioativo ou marcado, contador geyger) bem como equipamentos adicionais (cassetes, secador de gel) sendo alguns de uso exclusivo (banho-maria, refrigeradores e micropipetas). A revelação por métodos de coloração com nitrato de prata torna-se mais atrativa, bastando seguir as normas gerais de segurança de laboratório e indicações dos fornecedores. Além disso, não requer equipamentos sofisticados usados na leitura automatizada. Diversos procedimentos para coloração com nitrato de prata estão disponíveis na literatura, destacando-se o método proposto por Creste et al. (2001) que é prático, eficiente e de baixo custo. A técnica AFLP detecta um maior número de locos, comparativamente às demais técnicas que revelam marcadores moleculares, possibilita ampla cobertura do genoma e apresenta um baixo custo por informação (loco). A utilização de enzimas de restrição combinada com condições adequadas à hibridização dos primers durante as reações de amplificação agrega a robustez da técnica de RFLP com a praticidade da PCR. Marcadores AFLPs reúnem a capacidade exploratória dos polimorfismos dos RFLPs (presença ou ausência de sítios de restrição) com a vantagem da PCR. Devido a essas características, pouco a pouco, os marcadores RAPD vêm sendo substituídos pelos AFLPs. REFERÊNCIAS CRESTE, S.; TULMANN NETO, A.; FI- GUEIRA, A.V.O. Detection of single sequence repeat polymorphims in denaturing polyacrylamide sequencing gels by silver staining. Plant Molecular Biology Reporter, 19, 229-306, 2001. FERREIRA, M.E.; GATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 2. ed. 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BIOtecnologia Ciência & Desenvolvimento, 20, 16- 19. 2001. 60 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & Desenvolvimento - nº 29
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