1993; James et al., 1993). Uma vez conhecida a sequência desta proteína, a sua identificação é geralmente feita por correlação de dados depositados em bancos acessíveis via internet, como o da Swiss-Prot (Suiça). Técnicas e Opções para Análise de Proteoma Diferencial O proteoma diferencial compara diferentes perfis de proteínas entre situações de interesse. O objetivo central do proteoma diferencial é melhorar o conteúdo de informações do estudo de proteoma através de análises múltiplas. As três principais técnicas usadas atualmente para análise de proteoma diferencial são eletroforese diferencial em gel (DIGE), “Multplex Proteome” (MP) e rotulação de proteínas com reagentes ICAT (“isotopecoded affinity tagging”). A técnica DIGE (Figura 4) usa ésters de succinil de corantes de cianina, CY2, CY3 e CY5, que podem ser empregados para rotulação fluorescente para três populações complexas de proteínas antes de misturá-las e resolvê-las simultaneamente na mesma 2DE. Recentemente, foi desenvolvido outro procedimento similar usando corante Alexa Fluor. O “Multplex Proteome” (MP) baseia-se na determinação paralela dos níveis de expressão de proteínas bem como em certos atributos funcionais, tais como níveis de glicosilação, capacidade de ligação com drogas ou metabolização de drogas (Figura 5). Esta tecnologia utiliza o mesmo fluoróforo para medir proteínas através de todos os géis no banco de dados, e emprega fluoróforos adicionais com diferentes excitações e/ou emissão máxima para acentuar atributos funcionais específicos da espécie. A vantagem desta técnica sobre a DIGE é que ela dá uma faixa muito mais larga de informações. A técnica de ICAT permite identificação sistemática das proteínas numa mistura complexa e quantificação precisa das diferenças em abundância de cada proteína presente em duas ou mais amostras protéicas. O reagente ICAT é formado por três componentes funcionais: um grupamento reativo à tióis, que é seletivo para os grupamentos sulfidrilas das cadeias laterais de cisteínas reduzidas, um grupo de etileno glicol que pode conter átomos de deutério (isotopicamente pesado) ou não (isotopicamente normal) e que possibilita realizar quantificação precisa por MS, e um grupamento de biotina que é a “etiqueta de afinidade” utilizado como base para o isolamento seletivo dos peptídios contendo cisteína (marcados com ICAT) de uma mistura complexa de peptídios, através de cromatografia de afinidade em coluna de avidina (Figura 6). Os resíduos de cisteína reduzida das proteínas nas duas amostras a serem comparadas são rotulados separadamente durante o experimento. Em uma das amostras é usada a forma isotopicamente pesada e na outra amostra a forma leve do reagente ICAT. As duas amostras são combinadas e digeridas com tripsina. Os peptídios marcados, que contém cisteína são isolados por cromatografia de afinidade e analisados por espectrometria de massa, determinando assim a identidade da proteína que deu origem ao peptídio e a abundância relativa de cada proteína nas amostras sendo comparadas (Figura 7) (Gygi et al., 1999). Conclusões A Proteômica veio para revolucionar os estudos de Genoma, uma vez que utiliza-se de suas ferramentas para identificar as proteínas expressas em situações específicas em um dado momento naquele ambiente. A Proteômica é dinâmica e permite fazer estudos comparativos. Os métodos para análise global da abundância de proteínas, modificações pós-traducionais e as mudanças nesses dois parâmetros como a função de um estado biológico da célula ou tecido se desenvolveram utilizando-se das técnicas de eletroforese, cromatografia e espectrometria de massa como componentes-chave para o estabelecimento de plataformas de estudo. As inovações tecnológicas na detecção, análise e quantificação de proteínas acelerou rapidamente o desenvolvimento da Proteômica nos últimos 4 anos. Isso, sem dúvida, ocorreu devido ao foco que instituições privadas e públicas deram à pesquisa do Genoma ao Proteoma. No Brasil, a Proteômica vem se desenvolvendo desde o início do Projeto Genoma da Xyllela fastidiosa financiado pela Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FA- PESP). Diversos grupos inseridos no Genoma Funcional da FAPESP ainda continuam trabalhando com técnicas proteômicas com o objetivo de mapear as proteínas funcionais importantes no estabelecimento da doença do “amarelinho”e a sobrevivência da bactérianaslaranjeirasvariedadedoce. Com os resultados obtidos destes estudos espera-se criar estratégias de controle desta doença, a qual já tem causado sérios danos à citricultura paulista. 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