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MARCADOR MICROSSATÉLITE NA CONSERVAÇÃO DE GERMOPLASMA VEGETAL PESQUISA Fotos e ilustrações cedidas pelos autores APLICAÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES DO TIPO MICROSSATÉLITE NA CARACTERIZAÇÃO E CONSERVAÇÃO DE RECURSOS GENÉTICOS VEGETAIS MANTIDOS EM BANCOS DE GERMPLASMA Andrea Akemi Hoshino Mestranda em Genética andrea_akemi@hotmail.com Darío Abel Palmieri Doutorando em Genética dario@ibb.unesp.br Juliana Pereira Bravo Mestranda em Genética jpbravo@yahoo.com.br Tatiany Elizabeth Barata Pereira Doutoranda em Genética tatianyb@bol.com.br Catalina Romero Lopes Professora Titular em Genética catalina@ibb.unesp.br Marcos Aparecido Gimenes Professor Doutor em Genética gimenes@laser.com.br INTRODUÇÃO O Brasil é, reconhecidamente, o país com a maior biodiversidade do planeta. Os recursos genéticos são uma parte bastante importante dessa biodiversidade e são definidos como “o material genético de valor real ou potencial para o ser humano” (Decreto legislativo n o 2 de 08.02.94 apud Walter, 2000). Os recursos genéticos vegetais compreendem plantas cultivadas e espécies silvestres com valor comprovado ou mesmo potencial. A manutenção desses recursos realiza-se por meio do estabelecimento de áreas de proteção ambientais e pela coleta e manutenção desses materiais os quais passam a ser denominados germoplasma. A manutenção adequada de germoplasma depende, em grande parte, da avaliação e caracterização da variabilidade genética contida no mesmo. Esta avaliação contribui para prevenção de possíveis perdas genéticas, como as que podem acontecer durante as multiplicações dos acessos coletados e, possibilitam o estabelecimento dos sítios ou áreas de coletas que contenham maior variabilidade, auxiliando assim na planificação de novas coletas. A avaliação da variabilidade genética em germoplasma depende da disponibilidade de marcadores polimórficos e neutros do ponto de vista do efeito ambiental. Neste sentido, avaliações de variabilidade genética em germoplasma de plantas realizam-se utilizando-se vários marcadores baseados na análise direta do DNA (Powell et al., 1995; Galgaro et al., 1998; León et al., 1998; Gimenes et al., 2000, Manifesto et al., 2001). Nos últimos anos, marcadores do tipo microssatélite têm sido a ferramenta molecular mais utilizada em estudos ecológicos e genéticos. Os microssatélites, também denominados SSR (“Simple Sequence Repeats”), são formados por seqüências de uma a seis bases de comprimento repetidas em “tandem” (Jacob et al., 1991), encontrados em alta freqüência e com ampla distribuição nos genomas de eucariotos (Tóth et al., 2000). A análise de locos microssatélites é realizada por meio da técnica de PCR (“Polymerase Chain Reaction”) utilizando-se iniciadores (“primers”) complementares (18 a 25 bases) às regiões que os flanqueiam. Figura 1 – Gel de acrilamida 4% corado com prata. Foram utilizados para amplificação “primers” para o loco Ah-3 e DNAs de 20 cultivares de A. hypogaea (AABB) (1-20), um acesso de A. ipaënsis (BB) (21) e um acesso de A. duranensis (AA) (22). (M) Marcador molecular de 10 pares de base 146 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & Desenvolvimento - nº 29
Figura 2 – Índices de variabilidade genética para o loco Ah-282 calculados a partir da análise de 50 acessos de Arachis Kuhlmannii. EmApode se observar a variação no número de alelos em relação ao número de acessos eemBa variação do nível de heterozigosidade em relação ao tamanho da amostra Entre as vantagens apresentadas pelo marcador microssatélite para avaliação de germoplasma podemos considerar as seguintes: 1 - codominância, a possibilidade de detecção de todos os alelos em um dado loco em um dado indivíduo, o que permite a determinação de todos os alelos presentes em uma população e o cálculo das suas freqüências; 2 - elevado número de alelos, isto é, alto polimorfismo intraespecífico em cada loco, o que torna este loco informativo em populações diferentes permitindo a caracterização de diferentes acessos em uma coleção; 3 - praticidade na integração e comparação dos dados obtidos, que é decorrente do fato dos mesmos serem analisados por PCR utilizando-se “primers” específicos que permitem a amplificação de locos individuais. Neste sentido, marcadores do tipo RAPD e RFLP dificultam a integração dos dados devido a pouca repetibilidade, baixo polimorfismo e erros na interpretação dos resultados obtidos, uma vez que um grande número de locos é detectado ao mesmo tempo em uma única análise. Outra grande vantagem dos microssatélites é a possibilidade de utilização em espécies relacionadas de “primers” desenvolvidos para uma determinada espécie na detecção de locos SSR, processo esse denominado de transferabilidade ou amplificação cruzada. Isso permite que uma outra espécie seja avaliada com marcadores potentes, sem a necessidade de gastos com o desenvolvimento de “primers”. Os “primers” que se comportam desta forma são denominados heterólogos e sua aplicação será discutida mais adiante. Isolamento de microssatélites e escolha dos “primers” Os primeiros trabalhos utilizando microssatélites foram realizados em meados da década de 80. Desde então, os métodos de isolamento de locos de microssatélites têm sido aperfeiçoados e vários protocolos publicados. Uma ampla revisão sobre o assunto pode ser encontrada em Zane et al. (2002). Nos primeiros protocolos, os locos de microssatélites eram identificados em clones de bibliotecas genômicas totais utilizando-se sondas complementares às regiões de interesse, como por exemplo, (AC) 10 e (AG) 20 (Rassmann et al., 1991). Estes protocolos são eficientes, no entanto, o custo para desenvolvimento de um marcador microssatélite acaba sendo alto, pois, por se tratar de uma biblioteca de DNA genômico total, um grande número de clones deve ser avaliado para se encontrar aqueles que contenham microssatélites. Com o tempo, este problema foi sendo minimizado com o desenvolvimento de protocolos cada vez mais eficientes para o enriquecimento das bibliotecas, isto é, protocolos que aumentam a freqüência de clones que contêm um dado tipo de microssatélites a partir da subtração dos clones que não possuam o tipo de seqüência em seleção. Paetkau (1999) desenvolveu bibliotecas genômicas enriquecidas para repetições do tipo AC, com 40 a 100% de nível de enriquecimento. Este autor utilizou protocolos com marcação dos clones positivos através da extensão de cadeia usando como “primers” oligonucleotídeos biotinilados complementares ao microssatélite em questão. Os clones marcados foram separados com auxílio de estreptavidina ligada a partículas magnéticas. A estreptavidina é uma proteína produzida pela bactéria Streptomyces avidinii, a qual liga-se com grande afinidade à biotina (Sano et al., 1994). Esta metodologia é bastante eficiente, porém envolve um grande número de passos em seu desenvolvimento. Uma outra estratégia bastante difundida e menos laboriosa que a primeira promove a seleção dos clones positivos através da hibridação dos mesmos com sondas de oligonucleotídeos marcadas com biotina (Karagyozov et al., 1993; Armour et al., 1994; Kijas et al., 1994). Neste caso, os clones positivos também são isolados por separação magnética com auxílio de estreptavidina ligada a partículas magnéticas. Os protocolos baseados nesta estratégia precisam da ligação do DNA digerido com enzimas de restrição a um vetor de clonagem ou adaptadores de seqüência conhecida. A <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & Desenvolvimento - nº 29 147
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