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Figura 2. Curva experimental de crescimento da Acinetobacter johnsonii em meio suplementado com pesticida, para concentrações de campo e 10X mais concentrado: a) Diuron, b) Iprodione, c) Propanil, d) 3,4 Dicloroanilina, e) Metalaxil, f) Curva experimental de crescimento da Acinetobacter johnsonii em meio suplementado com 1% Dextrose: Teste verificação de ocorrência de degradação do Metalaxil pela bactéria Acinetobacter johnsonii, pois foi verificado que Pythium sp não cresce em altas concentrações deste fungicida. Foram preparados dois erlenmeyers contendo meio de cultura de sais minerais líquido (MS), sendo posteriormente autoclavados e suplementados com 10 µg.i.a.ml -1 de Metalaxil cada. Em um erlenmeyer foi colocada à bactéria Acinetobacter johnsonii e em outro não, pois este era o controle. Os erlenmeyers foram levados para agitador orbital a 150 rpm, em temperatura de 32°C por dez dias. Após este período os erlenmeyers foram retirados e acrescentaram-se 3,2g de ágar em cada erlenmeyer, que foi autoclavado novamente por 15 minutos na temperatura de 121ºC. O Pythium aphanidermatum foi então inoculado em placa de petri contendo o meio de cultura MS preparado anteriormente, e incubado por dois dias em estufa com temperatura controlada de 28°C. Foram realizados visualização macroscópica e registro fotográfico para análise do experimento. 3.RESULTADOSEDISCUSSÃO Através da seleção das seis linhagens bacterianas, Acinetobacter johnsonii foi à única linhagem apta a crescer em todos os pesticidas testados, em ambas as concentrações. Por essa razão foi selecionada para o teste de cinética de crescimento (Figura 1). No entanto, outros parâmetros tais como adição de fontes de nitrogênio ou mesmo aminoácidos não foram avaliados neste estudo, os quais poderiam contribuir para aumentar a capacidade metabólica de algumas destas linhagens (SPESSOTO, 2002). Na literatura não foram encontradas pesquisas com Acinetobacter capazes de metabolizar os pesticidas utilizados no presente estudo. No entanto, HAO (2002), verificou que espécies do gênero Acinetobacter demonstram capacidade em utilizar fenol e clorofenol transformando-os em metabólitos menos tóxicos. Outro estudo utilizando o microrganismo Streptomyces demonstrou que esta bactéria foi capaz de metabolizar doze diferentes tipos de herbicidas, sugerindo este microrganismo como alternativa na remediação de solos contaminados com herbicidas (SHELTON, 1996). Dos cinco pesticidas avaliados (Figura 2b), os maiores valores de absorbância foram observados para o fungicida Iprodione, na maior dose testada. Para o 3,4 Dicloroanilina (Figura 2d), o tratamento com a menor dose de aplicação (2,5µg.ml -1 ), houve aumento muito acentuado do crescimento nas primeiras 24 horas de incubação da bactéria, seguida de uma queda também acentuada ao final das 48 horas de incubação. Após este período o crescimento da Acinetobacter johnsonii na presença do 3,4 Dicloroanilina foi bem mais discreto, porém contínuo. Provavelmente no caso da Acinetobacter johnsonii, as enzimas envolvidas na degradação inicial da molécula da anilina sejam inespecíficas e, desta forma podem agir prontamente na molécula. No entanto, para ocorrer o ataque ao anel aromático do metabólito, existe a necessidade de um período maior de adaptação das vias metabólicas da bactéria, com a expressão de genes para a síntese de enzimas específicas para esta etapa de degradação (SPESSOTO, 2002). As vias metabólicas da Acinetobacter johnsonii estariam teoricamente aptas à degradação das moléculas fungicidas (iprodione, Metalaxil), enquanto que no caso das moléculas herbicidas (Diuron, Propanil), haveria a necessidade de uma maior fase de aclimatação ou adaptação deste microrganismo (SPESSOTO, 2002). No teste de sensibilidade do microrganismo Pythiumaphanidermatum em relação ao Metalaxil, o microrganismo demonstrou ser sensível a concentrações superiores a 2 µg.ml -1 , o que faz deste um possível bioindicador do composto. Na literatura não foi encontrado nenhuma pesquisa com este microrganismo como indicador da presença de fungicidas. Neste experimento foi notada a pre- 126 <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & Desenvolvimento - nº 29
associada ao microrganismo observada neste estudo, bem como buscar informações que possam esclarecer qual a importância deste tipo de associação para a ecologia do Pythiumaphanidermatum ese esta associação poderia, de alguma forma, estar agindo de forma a favorecer sua patogenicidade em plantas. 5.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Figura 3. Pythium sp, inoculado em concentrações de Metalaxil de 0,001 µg.ml -1 e2µg.ml -1 Figura 4. Teste de degradação do pesticida Metalaxil pela bactéria Acinetobacter jonhsonii utilizando o microrganismo Pythium sp como bioindicador sença de uma bactéria contaminante crescendo somente nas concentrações superiores a 2µg.ml -1 de Metalaxil, o que seria a existência de uma associação (provavelmente simbiótica) entre a bactéria e o Pythium aphanidermatum Porém, de alguma forma, o Pythium aphanidermatum estaria inibindo seu desenvolvimento, seja pela produção de metabólitos (antibióticos) ou ainda competição natural no meio de cultura para obtenção de carbono e energia. Portanto, quando o Pythium aphanidermatum cessava o crescimento devido a presença do metalaxil a bactéria iniciava o seu crescimento (Figura 3). No teste de degradação do Metalaxil pela bactéria Acinetobacterjohnsonii não foi comprovado que a bactéria degradou o composto, pois o Pythium aphanidermatum não cresceu no meio de cultura preparado, porém isto não invalida a hipótese de degradação, já que a Acinetobacter johnsonii pode ter degradado até restar concentração próxima a 2µg.ml -1 4.CONCLUSÕES Este trabalho mostrou que a bactéria Acinetobacter johnsonii pode ser uma ótima alternativa na remediação de solos contaminados com pesticidas. No entanto, para que esta linhagem seja considerada como ferramenta para detoxificação ambiental é necessário que estudos posteriores sejam conduzidos, no sentido de monitoramento da viabilidade celular da bactéria no ambiente, sua competitividade e capacidade degradativa, além dos possíveis impactos para a microbiota nativa pela sua introdução. O Pythiumaphanidermatum, fitopatógeno de grande importância em diversas culturas agrícolas, tem sido controlado quimicamente, através da aplicação do fungicida metalaxil com sucesso. Neste estudo, o microrganismo se revelou promissor como ferramenta na detecção de contaminação de amostras ambientais pelo fungicida. No entanto, outras avaliações deverão ser efetuadas no sentido da identificação da bactéria ALEXANDER, M. Biodegradation and Bioremediation. San Diego: Academic Press, 1994. 302p. CHEN, S. -K.; EDWARDS, C. A. A Microcosm Aproach to Assess the Effects of Fungicides on Soil Ecological Processes and Plant Growth: Comparisons of Two Soil Types. Soil Biology & Biochemistry, Vol. 33, p. 1981-1991, 2001. DELLAMATRICE, P. M. Degradação do Herbicida 14 C Diuron por Acinetobacter baumannii e pela Microbiota do Solo. 2000. 53p. Tese (Mestrado). HAO, O. J.; KIM, M. H.; SEAGREN, E. A.; KIM, H. Kinetics of phenol and chorophenol utilization by Acinetobacter species. Chemosphere, Vol. 46, p. 797 - 807, 2002. MELO, I.S.; SILVA, C.M.M.S.; SCRAMIN, S.; SPESSOTO, A. Biodegradação. Jaguariúna: EMBRAPA Meio Ambiente, 2001. 440 p. PRADO, A.G.S. Efeitos Provocados por Pesticidas Livres ou Ancorados em Sílica Gel na Microbiota do Solo. 2001. 127p. Tese (Doutorado) Faculdade de Engenharia Química, Universidade Estadual de Campinas, Campinas. ROQUE, M.R.A. Isolamento, Caracterização e Ecologia de Acinetobacterbaumannii Degradadora do Herbicida Diuron. 2000. 119p. Tese (Doutorado) - Faculdade de Ciências Biológicas, Universidade Estadual Paulista, Rio Claro. SHELTON, D. R.; KHADER, S.; KARNS, J. S.; POGELL, B. M.Metabolism of twelve herbicides by Streptomyces. Biodegradation, Vol. 7, p 129 -136, 1996. SKIPPER, H. D.; TURCO, R. F. Bioremediation: Science and Applications. Soil Science Special Publication (Number 43), 1995. 322 p. SPESSOTO, A. M. Dissipacao do fungicida metalaxil em solos brasileiros e caracterizacao genetica por RAPD de isolados envolvidos no processo. 2002. Tese (Doutorado) - UFSCar, São Carlos. WOTHING, C; HANCE, R. J. The Pesticide Manual: A World Compendium. Farham: British Crop Protection Council (BCPC), 1991. 1141p. <strong>Biotecnologia</strong> Ciência & Desenvolvimento - nº 29 127
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