Untersuchung des genetischen Schadens in peripheren ...

Erscheinungsbild sind sie leicht zu erkennen, haben somit zweifelsohne eine
Kernteilung vollzogen und sind nun in der Lage, Mikrokerne zu bilden (Fenech, 1993).
Um dieses Stadium zu erreichen, werden die kultivierten Zellen vor der ersten
Mitosephase mit Cytochalasin-B (Cyt.-B) behandelt und akkumulieren dann als
zweikernige Zellen, da Cyt.-B die Zytokinese hemmt, ohne jedoch die Karyokinese zu
beeinflussen.
Durch quantitative Erfassung der ein-, zwei- und mehrkernigen Zellen (> 2 Kerne) nach
einem definiertem Zeitpunkt kann dann nach einer bestimmten Formel, vorgeschlagen
von Eastmond und Tucker (1989), der Nuclear Division Index (NDI) errechnet werden.
So kann mit der Cytokinesis-block-Methode auf Ausmaß und Progression der
Kernteilung in einer sich teilenden Zellpopulation geschlossen werden. Außerdem
können zusätzliche Aussagen über cytostatische oder mitogene Eigenschaften der
untersuchten Substanzen innerhalb desselben Untersuchungsansatzes gemacht werden.
1.4.2 Comet-Assay (Einzelzell-Gelelektrophorese/ SCGE)
Der Comet-Assay stellt ein äußerst sensitives Testsystem dar, welches in der Lage ist,
eine Vielzahl von DNA-Schäden auf Einzelzellniveau (und das bereits bei sehr
niedrigen Schädigungslevels) direkt zu detektieren und zu quantifizieren.
Die zu untersuchenden Zellen werden nach spezieller Vorbehandlung einer
Gelelektrophorese unterworfen. Dabei wandert die negativ geladene DNA (die DNA
trägt aufgrund der Phosphatbrücken ihrer Basensequenz eine negative Ladung) bei
Anlegen eines elektrischen Feldes zum Pluspol (Anode). Hierbei können kleine DNA-
Bruchstücke schneller als große DNA-Fragmente durch das Gel wandern; es erfolgt
eine Auftrennung der DNA nach ihrer Größe. Somit kann sich die geschädigte DNA
von der eigentlichen Kern-DNA entfernen. Die Menge der migrierten DNA ist dabei
proportional zur DNA-Schädigung. Nach spezifischer Färbung der DNA erscheinen
geschädigte Zellen daher als „Komet“ unter dem Mikroskop (siehe Abbildung 2 und 3).
Der erste Ansatz, in Agarose eingebettete Zellen einer alkalischen Lyse zu unterziehen,
das Verhalten dieser alkalidenaturierten DNA in einem elektrischen Feld zu verfolgen,
um eine Aussage über den vorliegenden DNA-Schaden treffen zu können, stammt von
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