Untersuchung des genetischen Schadens in peripheren ...

Kammer auf die gewünschte Zellzahl von ca.0,8*10 5 -1,2*10 6 Zellen pro ml (max. 200
Zellen) durch Zugabe von Medium eingestellt werden.
2.7.2 Anfertigung der Zellpräparate für den Comet-Assay
Hierzu werden mit Agarose beschichtete Objektträger benötigt. Die aufgerauhten
Objektträger (Labcraft, Dakin Fully Frosted, Curtin Matheson Scientific Inc.,
Houston/Texas) werden mit 300-400 µl 0,75 % HMP-Agarose beschichtet (nachdem sie
vorher zweimal aufgekocht wurde), mit Deckgläsern versehen und anschließend für
zehn Minuten im Kühlschrank zur Aushärtung verwahrt.
Nun werden die Deckgläser vorsichtig abgezogen. Mit dieser Methode wurde in
regelmäßigen Abständen eine größere Anzahl von Objektträgern vorbereitet und bis zur
Verwendung geschützt aufbewahrt.
Die gut resuspendierten Lymphozyten mit einer Zelldichte von ca. 1*10 6 Zellen pro ml
(siehe 2.7.1) werden im Verhältnis von 20 µl Zellsuspension zu 180 µl 0,5 % LMP-
Agarose (1:10) in die 37°C warme Agaroselösung aufgenommen, vorsichtig gemischt
und 45 µl des Gemisches als zweite Schicht auf den Objektträger gegeben. Mit einem
Deckglas versehen lässt man die neu aufgetragene Agaroseschicht für ca. fünf Minuten
im Kühlschrank bei 4°C aushärten. So lassen sich Risse in der Agarose beim
anschließenden Ablösen des Deckglases vermeiden.
Die Präparate werden dann für mindestens eine Stunde bei 4°C lichtgeschützt in die
Lyselösung gestellt. Der Ausschluss von Licht dient der Vermeidung von zusätzlichen,
lichtinduzierten Strangbrüchen und ist auch für alle folgenden Arbeitsschritte
einzuhalten.
Nach der Lyse werden die Objektträger in die Elektrophoresekammer eingebracht
(vorher sorgfältig abtropfen lassen) und mit Elektrophoresepuffer auf 4°C gekühlt
überschichtet.
Die Präparate werden nun für 20 Minuten (ebenfalls gekühlt) im Elektrophoresepuffer
belassen. Diese Alkalibehandlung (pH 13), das sogenannte „Unwinding“, dient der
Steigerung der Sensitivität. Danach wird die Elektrophorese mit 25 V und 300 mA
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