Untersuchung des genetischen Schadens in peripheren ...

gestartet. Die Laufzeit beträgt genau 20 Minuten. Die Stromstärke wird vor Beginn über
das Puffervolumen reguliert.
Anschließend werden die Zellpräparate nach sorgfältigem Abtropfen für fünf Minuten
mit Neutralisationspuffer überschichtet; nach erneutem Abtropfen wird die Gesamt-
DNA mit 20 µl Ethidiumbromidlösung gefärbt und mit einem Deckglas versehen.
Die Aufbewahrung bis zur Auswertung erfolgt lichtgeschützt bei 4°C in einer feuchten
Kammer.
2.7.3 Auswertung des Comet-Assay
Die quantitative Bestimmung des Schadens erfolgt mit einer 500-fachen Vergrößerung
mittels Fluoreszenzmikroskop (515-560 nm) und computergestützter Bildverarbeitung.
Dabei wird die Intensität des (in die DNA) interkalierten Ethidiumbromids gemessen.
Pro Ansatz wurden mindestens 50 Zellen (je 25 zufällig ausgewählt aus zwei
Objektträgern pro Ansatz; die Zellen sollten möglichst aus der Mitte des Objektträgers
stammen) und mit Hilfe des Bildanalyseprogramms NIH-Image ausgewertet. Dabei
wird der Bereich der Gesamt-DNA (Kern- und Schweif-DNA) und die Fläche des
Kometenschweifs bestimmt. Das Programm kann so die integrierte Dichte der
ausgewählten Fläche (Summe der Grauwerte jedes Pixels entspricht dem
Fluoreszensignal der jeweiligen Fläche) berechnen. Zur Quantifizierung wird der
Quotient aus der Dichte des Kometenschweifs (geschädigte DNA) und der Gesamt-
DNA (Kern- und Schweif-DNA) gebildet. Als Maß für die Schädigung der DNA gilt
der bestimmte Anteil an DNA im Schweif, angegeben in Prozent.
Berechnet wurden jeweils Mittelwert, Median, Standardabweichung und die 1./3.
Quartile.
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