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11. Zugabe von jeweils 25 µl biotyniliertem Peptid in befüllte Wells.<br />
12. Versiegeln der Immunoplatte mit Acetat-Versiegelung (Acetat Plate Sealer,<br />
APS)<br />
mit anschließender Inkubation über zwei Stunden bei Raumtemperatur.<br />
13. Verdünnung von 12 µl der SA-HRP mit 12 ml Pufferlösung.<br />
14. Entfernen der APS-Versiegelung.<br />
15. Viermaliges Waschen der Wells mit 350 µl Pufferlösung.<br />
16. Zugabe von 100µl SA-HRP-Lösung in jedes Well.<br />
17. Erneutes Versiegeln mit APS und Inkubation für eine Stunde bei<br />
Raumtemperatur.<br />
18. Waschen wie Schritt 15.<br />
19. Zugabe von jeweils 100µl TMB-Substrat in befüllte Wells.<br />
20. Versiegeln wie Schritt 17.<br />
21. Entfernen der APS-Versiegelung. Zugabe von 100µl 2N HCl in jedes Well,<br />
um die Reaktion zu stoppen. Es sollte sich eine Farbumschlag von blau nach<br />
gelb zeigen.<br />
22. Auslesen der Absorption der Wells über einen Microtiter-Reader bei einer<br />
Wellenlänge von 450 nm.<br />
3.6.4.2 Standardkurve<br />
Die Standardkurve und die nachfolgenden Berechnungen der Peptidkonzentrationen<br />
wurden mit Hilfe des Statistikprogramms GraphPad Prism, Version 4.0 (GraphPad,<br />
La Jolla, CA, USA) erstellt. Die Konzentration der Standardpeptide wurde<br />
logarithmisch auf die x-Achse gegen die Absorption (OD) linear auf der y-Achse<br />
aufgetragen (Abbildung 12). Die Konzentration des CCK in der Probe wurde durch<br />
Vergleich der jeweiligen Absorption bei 450 nm ermittelt.<br />
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