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V.3 SUSTANCIAS DE REFERENCIA V.3.1 Preparación de las soluciones patrones Los patrones más concentrados de carbamazepina, difenilhidantoína y fenobarbital son preparados en metanol a partir de la droga sólida. Pesar 5 mg de cada una de las 3 drogas por separado y llevar a volumen en matraz de 5 ml aforado y calibrado. Preparación de los calibradores: Como matriz de los calibradores se utilizan agua o sueros libres de drogas y HIV negativos. Se alicuota en tubos y se congelan para ser utilizados en las siguientes corridas. Para ello, tomar 100ul de la solución de carbamazepina, difenilhidantoína y fenobarbital y volver a llevar a 5 ml en matraz aforado y calibrado con agua o plasma libre de drogas a cuantificar. Luego se realizan diluciones para obtener la curva de calibración (QC) si se preparan en el laboratorio. V.3.2 Estándares Nombres: Fenobarbital (ácido 5-etil-5-fenilbarbitúrico) Origen: Instituto Nacional de Farmacología y Bromatología, actual Instituto Nacional de Medicamentos, (INAME) Difenilhidantoína o fenitoína (5,5-Difenilhidantoina) Origen: Sigma Carbamazepina Origen: Sigma-Aldrich V.4 CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS V.4.1 Cromatógrafo: Bomba Thermo Spectra System P 2000 Detector Thermo Spectra System UV 1000 Loop: 100 µl 100
Columna: ODS2 150 X 4,6, tamaño de partícula 3 µm Temperatura ambiente Programa para adquisición de datos: PeakSimple Flujo: 1 ml/min Longitud de onda 210 nm V.4.2 Reactivos Acetonitrilo grado HPLC Agua destilada obtenida en el laboratorio Acetato de sodio grado analítico Ácido acético grado analítico V.4.3 Fase móvil Acetato de sodio 5 mM pH: 5,4 / acetonotrilo 100:65. La preparación de la fase móvil consiste en pesar 0,285g de acetato de sodio (PM 82) y se lleva a aproximadamente 450 ml con agua. Agitar hasta disolución de la droga. Se mide el pH utilizando el pHmetro Hanna HI 98127. Se ajusta el pH a 5,4 con ácido acético 1/10 del concentrado (Glacial). Llevar a 500 ml con agua. Se guarda refrigerado. La fase móvil se desgasifica por filtración al vacío. V.5 PREPARACIÓN DE MUESTRAS DE PLASMAS SUPLEMENTADO Origen de los plasmas: se obtuvieron plasmas, con EDTA como anticoagulante, del laboratorio, se poolearon y se verificó que los pooles no presentaran señal en el tiempo de retención de fenobarbital, carbamazepina y difenilhidantoína. Luego se suplementaron con volúmenes de soluciones estándar para llegar a concentraciones deseadas. 101
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