desarrollo y validación de metodología para minimizar la ...

3.2 REACTIVOS Y CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS:
Acetonitrilo grado HPLC
Agua destilada obtenida en el laboratorio
Acetato de sodio grado analítico
ZnSO4
Columna fase reversa C18, 15 cm, 5 µm
Inyector 100 µl
Flujo 1-1,5 ml
Longitud de onda 210 nm
Fase Móvil: acetato de sodio 5 mM pH: 5,4 / Acetonotrilo 100:65
La preparación de la fase móvil consiste en 0,285g de Acetato de sodio
(PM 82) y se lleva a aproximadamente 450 ml con agua. Agitar hasta
disolución de la sal. Se mide el pH utilizando el pHmetro Hanna HI
98127. Se ajusta el pH a 5,4 con ácido acético 1/10 v/v del concentrado
(Glacial). Llevar a 500 ml con agua. Se guarda refrigerado.
La fase móvil se desgasifica por filtración al vacío.
3.3 MUESTRA:
0,5 ml de suero.
3.4 TÉCNICA:
100 µl de suero o calibrador o control se desproteinizan por el agregado
de 100 µl de acetonitrilo puro 10 µl de ZnSO4 al 10%. Se agita 30
segundos en vortex a máxima velocidad y luego se centrifuga durante 4
min a maxima velocidad. 100 µl de sobrenadante límpido se pasan a
tubo nuevo y se diluye por el agregado de 300 µl de agua. Se agita en
vortex y se inyectan 100 µl en el sistema cromatográfico.
3.5 SOLUCIONES PATRONES Y CALIBRADOR:
Preparación de soluciones patrones
Patrones (son pesados en metanol). Pesar 5 mg de CBZ y llevar a
volumen en matraz de 5 ml aforado y calibrado.
Preparación de calibradores de CBZ
Como matriz de los calibradores se utilizan agua o sueros libres de
drogas y HIV negativos, suplementados con concentraciones conocidas
de Standard. Se alicuota en tubos nuevos y se congelan para ser
utilizados en las siguientes corridas.
Tomar 100 µl CBZ volver a llevar a 5 ml en matraz aforado y calibrado
con agua o plasma libre de droga a medir (nivel 4). Conjuntamente se
agregan DFH y FBT.
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