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V.6 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS Y ESTÁNDARES 100 µl de suero o calibrador o control se desproteinizan por el agregado de 100 µl de acetonitrilo puro mas 10 µl de ZnSO4 al 10%. Se agita 30 segundos en vortex y luego se centrifuga durante 4 minutos a máxima velocidad. 100 µl de sobrenadante límpido se pasan a tubo nuevo y se diluye por el agregado de 300 µl de agua. Se agita en vortex y se inyectan 100 µl en el sistema cromatográfico. V.7 PARÁMETROS DE VALIDACIÓN V.7.1 Selectividad y Especificidad Este parámetro se determinó procesando 6 muestras de distintos orígenes (plasmas libres de drogas), con el objetivo de evaluar, si en el tiempo de retención de fenobarbital, carbamazepina y difenilhidantoína no se registre señal cromatográfica. Asimismo no se observaron interferencias en el tiempo de retención correspondiente a fenobarbital, carbamazepina y difenilhidantoína en presencia de anticoagulante EDTA. Se procesaron también 3 plasmas hemolizados y 3 plasmas lipémicos (obtenidos con EDTA). En todos los casos, en el tiempo de retención de la molécula en estudio no se observó señal que pudiera interferir en la cuantificación de fenobarbital, carbamazepina y difenilhidantoína. La inyección de agua tampoco mostró señal en el tiempo de retención de fenobarbital, carbamazepina y difenilhidantoína. V.7.2 Rango Analítico El método fue desarrollado para los siguientes rangos: FBT: 1,25 µg/ml a 100 µg/ml CBZ: 0,25 µg/ml a 20 µg/ml DFH: 0,3125 µg/ml a 25 µg/ml 102
V.7.3 Linealidad El método es lineal en el rango de concentración de: FBT: 1,25 µg/ml a 100 µg/ml CBZ: 0,25 µg/ml a 20 µg/ml DFH: 0,3125 µg/ml a 25 µg/ml Se estudió la linealidad (y = ax + b), en varios días obteniendo en todas las rectas un coeficiente de correlación mayor a 0.98 (R 2 >0,98) V.7.4 Precisión intradía Se analizaron por quintuplicado plasmas suplementados en concentraciones bajas, medias y altas (QCB, QCM y QCA) obteniendo los siguientes resultados. Fenobarbital: Para concentración 11,19 µg/ml (QC bajo), el coeficiente de variación porcentual (CV%) es: Día 1: 2,0% Día 2: 2,0% Día 3: 1,2% Para concentración 28,33 µg/ml, (QC medio), el coeficiente de variación porcentual (CV%) es: Día 1: 0,7% Día 2: 2,3% Día 3: 7,8% Para concentración 62,19 µg/ml, (QC alto), el coeficiente de variación porcentual (CV%) es: Día 1: 1,9% Día 2: 2,6% Día 3: 0,9% Carbamazepina: 103
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