desarrollo y validación de metodología para minimizar la ...

3.2 REACTIVOS Y CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS:
Acetonitrilo grado HPLC
Agua destilada obtenida en el laboratorio
Acetato de sodio grado analítico
Columna Fase Reversa C18, 15 cm, 5 µm
Inyector 100 µl
Flujo 1-1,5 ml
Longitud de onda 210 nm
Fase Móvil: acetato de sodio 5 mM pH: 5,4 / Acetonotrilo 100:65.
La preparación de la fase móvil consiste en pesar 0,285g de acetato de
sodio (PM 82) y se lleva a aproximadamente 450 ml con agua. Agitar
hasta disolución de la droga. Se mide el pH utilizando el pHmetro
Hanna HI 98127. Se ajusta el pH a 5,4 con ácido acético 1/10 v/v del
concentrado (Glacial). Llevar a 500 ml con agua. Se guarda refrigerado.
La fase móvil se desgasifica por filtración al vacío.
3.3 MUESTRA:
0,5 ml de suero.
3.4 TÉCNICA:
100 µl de suero o calibrador o control se desproteinizan por el agregado
de 100 µl de acetonitrilo puro mas 10 µl de ZnSO4 al 10%. Se agita 30
segundos en vortex y luego se centrifuga durante 4 minutos a máxima
velocidad. 100 µl de sobrenadante límpido se pasan a tubo nuevo y se
diluye por el agregado de 300 µl de agua. Se agita en vortex y se
inyectan 100 µl en el sistema cromatográfico.
3.5 SOLUCIONES PATRONES Y CALIBRADOR:
Preparación de soluciones patrones
Patrones (son pesados en metanol). Pesar 5 mg de FBT y llevar a
volumen en matraz de 5 ml aforado y calibrado
Preparación de calibradores de FBT
Como calibradores se utilizan sueros libres de drogas y HIV negativos,
suplementados con concentraciones conocidas de standard. Se alicuota
en tubos nuevos y se congelan para ser utilizados en las siguientes
corridas.
Tomar 500 µl FBT volver a llevar a 5 ml en matraz aforado y calibrado
con agua o plasma libre de droga a medir (nivel 4). Conjuntamente se
agregan DFH y CBZ.
Nivel 3: tomar 1 ml de nivel 4 y diluir con 1 ml de agua o plasma libre
de droga.
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