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1 - OBJETIVO ANEXO N ° 2 PRÁCTICA DE CARBAMAZEPINA Determinar los niveles séricos de carbamacepina para control de los niveles circulantes en pacientes tratados en estado estacionario o en estudios de biodisponibilidad, mediante cromatografía líquida de alta presión y detección UV. Preparación de soluciones patrón y calibradores. 2 - ALCANCE Todas las muestra cuya solicitud médica indiquen el procesamiento para esta determinación. 3 - DESARROLLO Para el procesamiento de las muestras se sigue el procedimiento correspondiente al procesamiento de muestras en HPLC, donde se indican los pasos para el procesamiento de controles, calibración, evaluación de desempeño y procesamiento de muestras indicando los registros pertinentes. 3.1 FUNDAMENTO DEL TEST: La cromatografía líquida de alta presión utilizando columnas de fase reversa es una cromatografía en la cual el solvente o fase móvil es más polar que la fase estacionaria. Esto se debe a que se utiliza un componente químico no polar unido a la sílica como fase estacionaria, en este caso cadenas de 18 carbonos. De esta forma, solventes polares como agua, metanol, acetonitrilo, utilizadas en combinación con bufferes de diferente fuerza iónica son utilizados para eluir la muestra. Dado que la columna es no polar, moléculas más polares tendrán un tiempo de retención menor, resultando dicho tiempo dependiente de la polaridad y fuerza iónica de la fase móvil. La CBZ entonces es eluído aproximadamente a los 6-7 minutos siendo separado de los restantes anticonvulsivantes y otros componentes que puedan estar presentes en el suero. La detección se realiza por absorbancia a 210 nm. 150
3.2 REACTIVOS Y CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS: Acetonitrilo grado HPLC Agua destilada obtenida en el laboratorio Acetato de sodio grado analítico ZnSO4 Columna fase reversa C18, 15 cm, 5 µm Inyector 100 µl Flujo 1-1,5 ml Longitud de onda 210 nm Fase Móvil: acetato de sodio 5 mM pH: 5,4 / Acetonotrilo 100:65 La preparación de la fase móvil consiste en 0,285g de Acetato de sodio (PM 82) y se lleva a aproximadamente 450 ml con agua. Agitar hasta disolución de la sal. Se mide el pH utilizando el pHmetro Hanna HI 98127. Se ajusta el pH a 5,4 con ácido acético 1/10 v/v del concentrado (Glacial). Llevar a 500 ml con agua. Se guarda refrigerado. La fase móvil se desgasifica por filtración al vacío. 3.3 MUESTRA: 0,5 ml de suero. 3.4 TÉCNICA: 100 µl de suero o calibrador o control se desproteinizan por el agregado de 100 µl de acetonitrilo puro 10 µl de ZnSO4 al 10%. Se agita 30 segundos en vortex a máxima velocidad y luego se centrifuga durante 4 min a maxima velocidad. 100 µl de sobrenadante límpido se pasan a tubo nuevo y se diluye por el agregado de 300 µl de agua. Se agita en vortex y se inyectan 100 µl en el sistema cromatográfico. 3.5 SOLUCIONES PATRONES Y CALIBRADOR: Preparación de soluciones patrones Patrones (son pesados en metanol). Pesar 5 mg de CBZ y llevar a volumen en matraz de 5 ml aforado y calibrado. Preparación de calibradores de CBZ Como matriz de los calibradores se utilizan agua o sueros libres de drogas y HIV negativos, suplementados con concentraciones conocidas de Standard. Se alicuota en tubos nuevos y se congelan para ser utilizados en las siguientes corridas. Tomar 100 µl CBZ volver a llevar a 5 ml en matraz aforado y calibrado con agua o plasma libre de droga a medir (nivel 4). Conjuntamente se agregan DFH y FBT. 151
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