desarrollo y validación de metodología para minimizar la ...

puedan estar presentes en el suero. La detección se realiza por
absorbancia a 210 nm.
3.2 REACTIVOS Y CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS:
Acetonitrilo grado HPLC
Agua destilada obtenida en el laboratorio
Acetato de sodio grado analítico
Columna fase reversa C18, 15 cm, 5 µm
Inyector 100 µl
Flujo 1-1,5 ml
Longitud de onda 210 nm
Fase Móvil: acetato de sodio 5 mM pH: 5,4 / Acetonotrilo 100:65
La preparación de la fase móvil consiste en pesar 0,285g de acetato de
sodio (PM 82) y se lleva a aproximadamente 450 ml con agua. Agitar
hasta disolución de la droga. Se mide el pH utilizando el pHmetro
Hanna HI 98127. Se ajusta el pH a 5,4 con acido acético 1/10 v/v del
concentrado (Glacial). Llevar a 500 ml con agua. Se guarda refrigerado.
La fase móvil se desgasifica por filtración al vacío.
3.3 MUESTRA:
0,5 ml de suero.
3.4 TÉCNICA:
100 µl de suero o calibrador o control se desproteinizan por el agregado
de 100 µl de acetonitrilo puro mas 10 ul de Zn SO4.al 10% Se agita 30
segundos en vortex a máxima velocidad y luego se centrifuga durante 4
minutos a máxima velocidad. 100 µl de sobrenadante límpido se pasan
a tubo nuevo y se diluye por el agregado de 300 µl de agua. Se agita
en vortex y se inyectan 100 µl en el sistema cromatográfico.
3.5 SOLUCIONES PATRONES Y CALIBRADOR:
Preparación de soluciones patrones
Patrones (son pesados en metanol). Pesar 5 mg de DFH y llevar a
volumen en matraz de 5 ml aforado y calibrado.
Preparación de calibradores de DFH
Como calibradores se utilizan agua o plasma suero libres de drogas y
HIV negativos, suplementados con concentraciones conocidas de
standard. Se alícuota en tubos nuevos y se congelan para ser utilizados
en las siguientes corridas.
Tomar 125 µl DFH volver a llevar a 5 ml en matraz aforado y calibrado
con agua o plasma libre de droga a medir (nivel 4). Conjuntamente se
agregan CBZ y FBT.
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