Estudo do polimorfismo do sistema sangüíneo Diego em

Material e Métodos
Tabela 3: Seqüência dos primers utilizados para amplificação dos exons 4, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20.
Primer Exon Seqüência
DiEX4S 4 ( 5’3’) TTCAGCTCACGACACCGAGG
DiI4AS 4 (3’5’) AAGGTGAGGACCCCAGCCTC
DiI10S 11 (5’3’) TCCTCCAGCTACTCCCTCTGA
DiI11AS 11 (3’5’) CAGAGGGTCAGAGGCAAGAGT
DiI11S 12 (5’3’) CCTGGAAATGATCTCCTGACCT
DiI12AS 12 (3’5’) ACCATGCATCAGGCAGGTGGT
DiI12S 13 (5’3’) CCTTGCCCCAAGGCCCTTTGA
DiI13AS 13 (3’5’) CTTATACACAACCTCCCGTGTG
DiI13S 14 (5’3’) CCAAGCCAAAGCTGGGAGAGA
DiI14AS 14 (3’5’) GGGCTGGGATAGGGCAGTGT
DiI14S 15 (5’3’) GGGGAGTGACTGGGCACTGA
DiI15AS 15 (3’5’) ATGAGGACCTGGGGGGTATCA
DiI15S 16 (5’3’) CCATCCTCCTGCCCTTGGCA
DiI16AS 16 (3’5’) GCCAGGGAAAGGTCCCTGCC
DiI16S 17 (5’3’) GGAGAACCCTGCTTACCCCTC
DiI17AS 17 (3’5’) GAGGATGGTGAAGACGCGACC
DiI17S 18 (5’3’) AACCTGGGCTGAGAGTGTGCG
DiI18AS 18 (3’5’) TCTACCACCCCAGGCTGGGC
DiI18S 19 (5’3’) GGGGTGTGATAGGCACTGACC
DiI19AS 19 (3’5’) CCCTCGCATGCTCCCAGCTC
DiI19S 20 (5’3’) CTCTTCTGGCCCCAGGGTCT
DiEx20AS 20 (3’5’) TGCTCCAGGAGGATCCTGGAGT
5.7.1- PCR exons 11 - 20
A reação de PCR foi feita em tubo de 0,2 mL, ao qual foi adicionada a mistura
reacional para a amplificação contendo 5 L de DNA total na concentração de 0,1 g/
L, 5 L de tampão 10X (500 mM KCL, 100 mM Tris-HC pH 8,5, 15 mM de MgCl2),
33,50 L de água pura estéril (Mili-Q), 1 mM de cada desoxirribonucleotídeo – dNTPs
(dATP, dGTP, dCTP, dTTP, Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), 1 L de cada conjunto
de primer a 2,5 M e 0,5 U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen Life Technologies,
Brasil), perfazendo um volume final de 50 L.
Foi realizado um pré PCR em ciclador térmico (Perkin Elmer Cetus, Norwalk,
CT), nas condições: 94ºC durante 40 segundos; 62ºC durante 1 minuto e 72ºC durante 1
minuto.
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