Estudo do polimorfismo do sistema sangüíneo Diego em

Material e Métodos
Em seguida a reação foi conduzida durante 35 ciclos em ciclador térmico
(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), e cada ciclo foi feito nas seguintes condições: 94ºC
durante 40 segundos, 62ºC durante 1 minuto e 72ºC durante 1 minuto, para amplificação
dos exons 11, 12, 15, 18 e 19. Para os demais exons (13, 14, 16, 17 e 20) as condições
foram: 94ºC durante 40 segundos, 60ºC durante 1 minuto e 72ºC durante 1 minuto.
5.7.2- PCR exon 4
A reação de PCR foi feita em tubo de 0,2 mL, ao qual foi adicionada a mistura
reacional para a amplificação contendo 5 L de DNA total na concentração de 0,1 g/
L, 5 L de tampão 10X (500 mM KCL, 100 mM Tris-HC pH 8,5, 15 mM de MgCl2),
33,50 L de água pura estéril (Mili-Q), 2 nM de cada desoxirribonucleotídeo – dNTPs
(dATP, dGTP, dCTP, dTTP, Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), 50 pM de cada
conjunto de primer a 2,5 M e 1 U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen Life
Technologies, Brasil), perfazendo um volume final de 50 L.
Foi realizado um pré PCR em ciclador térmico (Perkin Elmer Cetus, Norwalk,
CT), nas condições: 94ºC durante 40 segundos; 62ºC durante 1 minuto e 72ºC durante 1
minuto.
Em seguida a reação foi conduzida durante 35 ciclos em ciclador térmico
(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), e cada ciclo foi feito nas seguintes condições: 94ºC
durante 40 segundos, 62ºC durante 1 minuto e 72ºC durante 1 minuto.
Todos os primers, com exceção DiEx20AS (exon 20), foram desenhados com o
objetivo de que a reação fosse iniciada nos introns adjacentes, portanto, os produtos de
amplificação apresentariam tamanhos maiores do que seus respectivos exons, exceção
feita ao produto de amplificação do exon 20 (tabela 4; figuras 11 a 21; anexo I).
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