Estudo do polimorfismo do sistema sangüíneo Diego em

Material e Métodos
condições: 1,0 KV; 35,0 mA; 50 W e temperatura de 51ºC; durante 8 horas. Os
eletroferogramas obtidos foram analisados através de programa “ABI PRISM TM 377
DNA Sequencing Analysis” – versão 3.3 (Perkin Elmer). As seqüências consenso foram
montadas a partir das obtidas separadamente com os primers sense (S) e antisense (AS)
de cada exon estudado, foram avaliadas e comparadas entre si e com o protótipo
(“GenBank accession number” X77738 e L35930 ), usando o programa “Sequencer”
versão 3.1.
5.9- Reação de PCR-RFLP (“Restriction Fragment Length
Polymorphism”)
Para confirmação do novo polimorfismo encontrado, G > A posição 1770 do
gene, o produto de amplificação do exon 14 foi digerido a 50ºC por duas horas com a
enzima de restrição: Apo I (New England Biolab , Beverly MA). A ação desta enzima,
diante do polimorfismo, cliva o produto de amplificação do exon 14 gerando 2 bandas
de 190 e 83 pb, quando revelado em gel de agarose a 2%, após corrida eletroforética.
Apo 1 foi utilizada em um volume final de 8,25 L, dispensando-se 10 L da mistura de
enzima/tampão, de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. Na ausência
do polimorfismo a enzima não digere o produto, portanto, ocorre uma banda única de
273 pb (figura 22).
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