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L 225/198 21.8.2001 Journal officiel des Communautés européennes FR 1.6.3. Exposition 1.6.3.1. Administration des doses 1.6.3.2. Durée Les abeilles anesthésiées sont traitées individuellement par application locale. Les abeilles sont réparties au hasard entre les groupes traités aux différentes doses et les groupes témoins. Un volume de 1 ll de solution contenant la substance d'essai à la concentration appropriée doit être appliqué à l'aide d'un micro-applicateur sur la face dorsale du thorax de chaque abeille. D'autres volumes peuvent être utilisés si cela se justifie. Après l'application, les abeilles sont réparties entre les cages d'essai dans lesquelles on distribue une solution de saccharose. L'essai dure 48 heures. Si la mortalité augmente de plus de 10 % entre 24 heures et 48 heures, la durée de l'essai doit être prolongée jusqu'à 96 heures, à condition que la mortalité des témoins ne dépasse pas 10 %. 1.6.4. Observations La mortalité est relevée 4 heures après l'application de la dose, puis 24 heures et 48 heures après celle-ci. Si une période d'observation prolongée est requise, d'autres évaluations devront être pratiquées à des intervalles de 24 heures pendant 96 heures au maximum, à condition que la mortalité des témoins ne dépasse pas 10 %. Tous les effets se traduisant par des anomalies du comportement pendant la période d'essai doivent être notés. 1.6.5. Essai limite Dans certains cas (par exemple lorsqu'on s'attend à ce qu'une substance d'essai soit peu toxique), un essai limite peut être exécuté avec 100 lg de substance active/abeille afin de démontrer que la DL 50 est supérieure à cette valeur. Le même protocole doit être appliqué, et notamment les 3 groupes d'essai identiques pour la dose testée, les témoins nécessaires et l'utilisation d'un étalon de toxicité. Si on constate une mortalité, il convient de mener une étude complète. Si on observe des effets sublétaux (voir point 1.6.4), il faut les noter. 2. RÉSULTATS ET RAPPORT 2.1. RÉSULTATS Les résultats doivent être récapitulés sous la forme de tableaux, montrant pour chaque groupe traité avec la substance d'essai, ainsi que pour les témoins et les groupes traités avec l'étalon de toxicité, le nombre d'abeilles employé, la mortalité à chaque heure d'observation et le nombre d'abeilles présentant un comportement anormal. Les données de mortalité seront analysées par les méthodes statistiques appropriées (par exemple, la méthode des probits, la moyenne mobile, la probabilité binomiale) (3) (4). On trace les courbes dose-effet pour chaque moment d'observation recommandé (24 heures, 48 heures, et, si nécessaire, 72 heures, 96 heures) et on calcule les pentes des courbes et les doses létales 50 % (DL 50) avec des limites de confiance de 95 %. Les corrections relatives à la mortalité des témoins doivent s'effectuer selon la méthode d'Abbott (4) (5). La DL 50 doit être exprimée en lg de substance d'essai par abeille. 2.2. RAPPORT D'ESSAI Le rapport d'essai doit contenir les informations suivantes: 2.2.1. Substance d'essai — État physique et propriétés physico-chimiques pertinentes (par exemple, stabilité dans l'eau, pression de vapeur), — données relatives à l'identification chimique, notamment la formule structurale, la pureté (dans le cas des pesticides, l'identité et la concentration de la ou des substances actives). 2.2.2. Espèce d'expérience — Nom scientifique, race, âge approximatif (en semaines), méthode et date de collecte, — informations sur les colonies dans lesquelles les abeilles ont été récoltées, en particulier l'état de santé, toute maladie des adultes, les prétraitements éventuels, etc.
21.8.2001 L 225/199 Journal officiel des Communautés européennes FR 2.2.3. Conditions d'essai — Température et humidité relative de la salle d'expérience, — conditions d'encagement, en particulier le type, la dimension et le matériau des cages, — modalités d'administration de la substance d'essai, par exemple, solvant utilisé, volume de solution d'essai appliqué, anesthésiants utilisés, — conception de l'essai, par exemple, nombre et niveau des concentrations d'essai appliquées, nombre de témoins; pour chaque concentration d'essai et témoin: nombre de cages et nombre d'abeilles par cage, — date de l'essai. 2.2.4. Résultats — Résultats d'une étude préliminaire de détermination de l'ordre de grandeur, le cas échéant, — données brutes: mortalité à chaque concentration testée et à chaque temps d'observation, — courbes dose/effet à la fin de l'essai, — valeurs de la DL 50 avec des limites de confiance de 95 %, à chaque temps d'observation recommandé, pour la substance d'essai et l'étalon de toxicité, — méthodes statistiques utilisées pour calculer la DL 50 — mortalité chez les témoins, — autres effets biologiques observés et toute réaction anormale des abeilles, — tout écart par rapport au protocole décrit ici et toute autre information utile. 3. BIBLIOGRAPHIE (1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products — Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151-165. March 1993. (2) Gough, H. J., McIndoe, E. C., Lewis, G. B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981-1992. Journal of Apicultural Research 22, pp. 119-125. (3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, pp. 99-113. (4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York. (5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, pp. 265-267.
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