situ hibridizasyon yöntemi i - Çukurova Üniversitesi

Floresan In-situ hibridizasyon
Her olguya ait seçilen parafin bloklardan alınan kesitler 3 µm kalınlığında
süperfrost-plus ile kaplanmış lamlara yerleştirildi ve hedef alan eş zamanlı alınan H&E
boyalı kesitlerle refere edilerek işaretlendi. Kesitlere in situ hibridizasyon için sırayla
aşağıdaki işlem basamakları uygulandı:
1- Slaytlar 56 °C’lik etüvde 14 saat bekletildi.
2- Deparafinizasyon için üç kez beşer dakika ksilende bekletildi.
3- Derecelendirilmiş etanolde üç defa beşer dakika bekletilerek dehidrate edildi
ve havada kurutuldu.
4- Lamlar 60 °C’de bir gece boyunca ön işlem solüsyonunda (sodyum
izosiyanat) bekletildi.
5- Etüvden çıkarılan kesitler oda sıcaklığındaki distile suda 5 dakika bekletildi.
6- 37 °C’lik etüvde pepsin solüsyonunda15 dakika bekletildi.
7- Oda sıcaklığındaki distile suda 5 dakika bekletildi.
8- Takiben 2XSCC solüsyonunda 3 dk bekletildi. Bu işlem solüsyon
değiştirildikten sonra tekrarlandı.
9- Kesitler sırayla % 70’lik, % 85’lik ve % 100’lük etanol serisinden 3’er dakika
geçirilerek havada kurumaya bırakıldı ve problama işlemine geçildi.
damlatıldı.
10- Kesitler kuruduktan sonra, üzerilerine 10µl. Prob (Abbott, İsviçre)
11- Problar lamelle kapatıldı ve lamellerin etrafı rubber cementle çevrildi.
12- Thermobrite cihazında 73 °C’de denatürasyona tabii tutuldu.
13- 37 °C’de bir gece hibridizasyona bırakıldı.
14- Ertesi gün sabah, kesitler 73 °C’de “yıkama solüsyonu-1”de (0,4xSCC/
%0,3’lük NP-40) 3 dk bekletildi.
15- Kesitler, oda sıcaklığındaki yıkama solüsyonu-2’de (2xSCC/%1’lik NP-40)
15 sn çalkalandı.
16- Kuruduktan sonra kesitlerin üzerine 10 µl Dapi (4,6 diamidinoz-
phenylindole) damlatıldı ve lamelle kapatıldı.
17- -20°C’de yarım saat bekletildi.
42