· 870· 中 华 行 为 医 学 与 脑 科 学 杂 志 2012 年 10 月 第 21 卷 第 10 期 ChinJBehavMed&BrainSci,October2012,Vol.21,No.10 拉 西 酮 治 疗 PTSD 机 制 的 相 关 研 究 尚 缺 乏 报 道 。 因 此 本 研 究 拟 在 PTSD 动 物 实 验 模 型 基 础 上 , 选 用 齐 拉 西 酮 干 预 模 型 大 鼠 , 探 讨 齐 拉 西 酮 对 PTSD 大 鼠 行 为 的 改 善 作 用 及 其 可 能 机 制 , 为 临 床 治 疗 PTSD 患 者 选 择 药 物 提 供 新 思 路 。 一 、 材 料 材 料 与 方 法 1. 动 物 :24 只 清 洁 级 成 年 雄 性 SD 大 鼠 , 体 质 量 (200±20)g, 由 第 四 军 医 大 学 实 验 动 物 中 心 提 供 。 大 鼠 随 机 分 为 对 照 组 (controlgroup), 模 型 组 (SPS&S group), 齐 拉 西 酮 组 (ziprasidonegroup), 齐 拉 西 酮 + U0126 组 (ziprasidone+U0126group)。 2. 主 要 试 剂 和 仪 器 : 齐 拉 西 酮 ( 美 国 sigma 公 司 ), 大 鼠 自 发 活 动 测 试 仪 ( 上 海 吉 量 ), 兔 抗 pERK1/2 抗 体 (rabbitantipERK1/2,Celsignaling 公 司 ),BCA 蛋 白 测 定 试 剂 盒 ( 碧 云 天 生 物 技 术 研 究 所 ), 化 学 荧 光 试 剂 ( 美 国 Milipore 公 司 )。 二 、 方 法 实 验 过 程 :SPS&S 造 模 结 束 后 , 连 续 7d 进 行 齐 拉 西 酮 及 U0126 干 预 ,24h 之 后 检 测 4 组 大 鼠 的 行 为 表 现 , 并 进 一 步 提 取 蛋 白 后 , 采 用 Westernblot 方 法 检 测 pERK1/2 表 达 水 平 。 1. 模 型 的 建 立 : 将 对 照 组 , 齐 拉 西 酮 组 , 齐 拉 西 酮 [7] +U0126 组 进 行 SPS&S 处 理 。 参 考 Wang 等 文 献 的 方 法 构 建 SPS&S 动 物 模 型 , 即 大 鼠 经 7d 的 适 应 饲 养 后 , 连 续 进 行 下 述 步 骤 处 理 : 将 大 鼠 禁 锢 2h 后 , 立 即 强 迫 性 游 泳 20min( 水 深 40cm, 水 温 4℃), 经 过 15min 的 恢 复 , 乙 醚 麻 醉 至 大 鼠 意 识 丧 失 , 麻 醉 清 醒 后 实 施 足 底 电 击 (1mA 持 续 4s)。 2. 给 药 方 案 : 齐 拉 西 酮 及 U0126 经 二 甲 基 亚 砜 (DMSO) 溶 解 后 , 用 生 理 盐 水 分 别 稀 释 为 所 需 浓 度 。 齐 拉 西 酮 组 :SPS&S 造 模 结 束 后 , 每 天 灌 胃 齐 拉 西 酮 (2.5mg/kg), 连 续 7d; 齐 拉 西 酮 +U0126 组 :SPS&S 造 模 结 束 后 , 连 续 7d 给 予 齐 拉 西 酮 之 后 0.5h, 腹 腔 注 射 U0126(0.5mg/kg)。 3. 旷 场 实 验 : 齐 拉 西 酮 干 预 结 束 后 24h, 对 四 组 大 鼠 进 行 旷 场 测 试 。 将 大 鼠 放 于 旷 场 行 为 观 察 箱 中 ( 直 径 47cm×47cm),10s 适 应 期 后 , 开 始 记 录 大 鼠 行 为 (10min), 采 用 cleversys 分 析 系 统 分 析 大 鼠 的 水 平 运 动 路 程 , 中 央 活 动 次 数 。 4. 高 架 十 字 实 验 : 齐 拉 西 酮 干 预 结 束 后 24h, 对 四 组 大 鼠 进 行 高 架 十 字 行 为 测 试 。 将 大 鼠 放 于 EPM 的 中 央 平 台 上 , 鼠 头 统 一 朝 向 固 定 方 向 ,10s 适 应 期 后 , 开 始 记 录 其 行 动 (5min), 记 录 大 鼠 进 入 开 臂 的 次 数 以 及 在 开 臂 停 留 时 间 等 行 为 指 标 。 5.Westernblot 检 测 pERK1/2 表 达 水 平 : 行 为 测 试 结 束 后 , 处 死 动 物 , 在 冰 上 迅 速 剥 离 大 脑 , 制 备 蛋 白 样 品 ,-20℃ 冰 箱 保 存 。 配 制 5% 的 积 层 胶 和 10% 的 分 离 胶 , 按 照 BCA 蛋 白 质 定 量 结 果 , 各 泳 道 上 样 40μg。 电 泳 90V/20min,160V/60min 结 束 ,100V/ 90min 将 凝 胶 中 蛋 白 转 移 至 PVDF 膜 ; 以 封 闭 液 (25mmol/LTBS 溶 液 ,5g/L 脱 脂 奶 粉 ,1ml/L 吐 温 -20) 室 温 封 闭 1h。 经 TBS 漂 洗 3×5min, 孵 育 一 抗 (rabbitantipERK1/2,1∶2000,TBST 稀 释 ), 入 4℃ 冰 箱 过 夜 ; 复 温 30min,TBS 漂 洗 3×5min; 入 二 抗 , 室 温 孵 育 1h;TBS 洗 膜 3×5min, 滴 加 化 学 荧 光 试 剂 , 在 暗 室 中 用 X 光 胶 片 压 片 成 像 。 扫 描 各 免 疫 印 迹 条 带 并 进 行 分 析 。 6. 统 计 学 处 理 : 采 用 SPSS13.0 进 行 数 据 统 计 分 析 。 各 组 之 间 的 比 较 用 单 因 素 方 差 分 析 , 两 两 数 据 比 较 前 进 行 方 差 齐 性 检 验 , 满 足 方 差 齐 性 则 采 用 LSD 检 验 , 方 差 不 齐 则 采 用 DunnetT3 检 验 , 以 P
中 华 行 为 医 学 与 脑 科 学 杂 志 2012 年 10 月 第 21 卷 第 10 期 ChinJBehavMed&BrainSci,October2012,Vol.21,No.10 ·871· 表 2 各 组 大 鼠 pERK1/2 表 达 水 平 的 比 较 (x±s, 每 组 n=6) 组 别 pERK1/2/βactin 对 照 组 2.37±0.25 SPS&S 组 1.90±0.16 a 齐 拉 西 酮 组 2.51±0.27 b 齐 拉 西 酮 +U0126 组 1.93±0.23 c F 值 7.07 P 值 0.01 注 : 与 对 照 组 比 较 , a P