· 866· 中 华 行 为 医 学 与 脑 科 学 杂 志 2012 年 10 月 第 21 卷 第 10 期 ChinJBehavMed&BrainSci,October2012,Vol.21,No.10 期 特 征 , 并 可 加 剧 疾 病 的 进 程 [12] 。AD 的 主 要 病 理 特 征 是 细 胞 外 淀 粉 样 蛋 白 (βamyloid,Aβ) 沉 积 形 成 的 老 年 斑 和 细 胞 内 tau 蛋 白 过 度 磷 酸 化 形 成 的 神 经 纤 维 缠 结 (neurofibrilarytangles,NFTs)。Aβ 是 导 致 AD 认 知 障 碍 形 成 的 主 要 因 素 [3] 。 研 究 发 现 , 侧 脑 室 灌 注 Aβ 可 导 致 小 鼠 学 习 记 忆 功 能 障 碍 [45] 。 黄 酮 类 化 合 物 来 源 广 泛 , 已 被 证 实 具 有 抑 制 Aβ 毒 性 的 神 经 保 护 作 用 [67] 。 漆 黄 素 (fisetin) 是 一 种 天 然 黄 酮 类 化 合 物 , 广 泛 存 在 于 水 果 和 蔬 菜 中 , 如 草 莓 、 苹 果 、 葡 萄 、 洋 葱 和 黄 瓜 等 [8] , 具 有 抗 癌 、 抗 炎 症 、 神 经 营 养 和 抗 氧 化 等 多 种 生 物 活 性 [911] 。 研 究 发 现 , 漆 黄 素 可 有 效 抑 制 神 经 细 胞 内 Aβ 原 纤 维 形 成 [12] , 增 强 小 鼠 的 长 时 记 忆 [13] 。 近 年 来 , 科 学 家 发 现 了 漆 黄 素 的 一 种 重 要 抗 氧 化 作 用 机 制 , 即 可 通 过 激 活 核 因 子 E2 相 关 因 子 2(nuclearfac torerythroid2relatedfactor2,Nrf2) 信 号 通 路 抑 制 细 胞 死 亡 [14] 。Nrf2 入 核 后 可 与 抗 氧 化 反 应 元 件 (antioxi dantresponseelement,ARE) 结 合 , 启 动 下 游 抗 氧 化 靶 基 因 表 达 , 抑 制 氧 化 应 激 。 这 些 研 究 结 果 提 示 , 漆 黄 素 很 可 能 是 有 效 的 AD 防 治 药 物 。 本 实 验 通 过 侧 脑 室 灌 注 Aβ(142) 建 立 AD 小 鼠 模 型 , 运 用 行 为 学 和 分 子 生 物 学 手 段 研 究 漆 黄 素 是 否 能 通 过 调 节 Nrf2 抗 氧 化 信 号 通 路 影 响 小 鼠 学 习 和 记 忆 功 能 。 材 料 与 方 法 一 、 材 料 1. 实 验 动 物 : 选 择 8~10 周 龄 , 体 质 量 (25±2)g, SPF 级 C57BL/6 雄 性 小 鼠 50 只 入 围 实 验 ( 由 江 苏 省 血 防 研 究 所 卫 生 部 重 点 实 验 室 动 物 实 验 中 心 提 供 ); 采 用 标 准 啮 齿 类 动 物 饲 料 饲 养 , 明 暗 周 期 为 12h, 温 度 25℃ 左 右 , 实 验 前 保 持 小 鼠 在 以 上 环 境 中 适 应 2 个 星 期 。 采 用 随 机 数 字 表 法 将 50 只 小 鼠 分 为 5 组 (n= 10), 分 别 为 空 白 对 照 组 ; 生 理 盐 水 +Aβ(421)( 无 毒 性 ); 生 理 盐 水 +Aβ(142)( 强 毒 性 ); 漆 黄 素 (10mg/kg) +Aβ(142); 漆 黄 素 (20mg/kg)+Aβ(142)。 2. 主 要 试 剂 与 仪 器 : 漆 黄 素 (Sigma, 美 国 ), Aβ(421) 和 Aβ(142)(AmericanPeptide, 美 国 ), 引 导 管 (EICOMCorp, 日 本 ), 小 鼠 脑 立 体 定 位 仪 (DavidKo pfInstruments, 美 国 ), 凝 胶 电 泳 仪 (Biorad, 美 国 ),NEPER 核 蛋 白 胞 浆 蛋 白 抽 提 试 剂 盒 (ThermoScientific, 美 国 ), 水 迷 宫 视 频 跟 踪 系 统 (EthoVision, 荷 兰 )。 二 、 方 法 1. 侧 脑 室 灌 注 Aβ: 参 照 之 前 的 手 术 方 法 [15] , 用 水 合 氯 醛 (200mg/kg) 腹 腔 注 射 麻 醉 小 鼠 , 固 定 于 脑 立 体 定 位 仪 上 , 消 毒 后 , 切 开 小 鼠 颅 顶 皮 肤 , 分 离 骨 膜 , 暴 露 出 前 卤 。 参 照 Watson 小 鼠 脑 立 体 定 位 图 谱 , 定 位 在 卤 后 0.5mm, 右 侧 旁 开 1mm。 在 拟 插 入 引 导 管 和 固 定 手 术 钉 位 置 处 用 牙 钻 钻 孔 ( 直 径 0.5mm)。 固 定 手 术 钉 , 将 引 导 管 固 定 于 立 体 定 位 仪 的 纵 向 坐 标 上 , 精 准 定 位 后 , 插 入 右 侧 脑 室 2mm, 并 将 手 术 钉 和 套 管 粘 合 。 将 Aβ(421) 或 Aβ(142) 溶 解 在 0.1mol/LPBS 中 (400pmol/5μl), 以 1μl/min 的 速 率 缓 慢 通 过 引 导 管 注 入 侧 脑 室 , 注 射 结 束 后 静 置 1min, 再 缓 慢 拔 出 注 射 针 头 。 2. 药 物 干 预 : 实 验 组 小 鼠 在 Aβ 灌 注 前 7d 开 始 每 天 给 予 漆 黄 素 (10mg/kg 或 20mg/kg) 药 物 干 预 , 并 持 续 至 实 验 结 束 。 3. 水 迷 宫 实 验 :Aβ 灌 注 后 第 3 天 开 始 进 行 水 迷 宫 实 验 。 前 4d 为 定 向 航 行 实 验 , 第 5 天 为 空 间 探 索 实 验 。 所 用 蓄 水 池 为 直 径 97cm, 高 65cm, 水 中 放 入 奶 粉 混 匀 , 整 个 实 验 过 程 中 保 持 水 温 恒 定 在 (23±2)℃。 将 水 池 划 分 为 4 个 象 限 , 透 明 平 台 放 置 在 其 中 一 个 象 限 的 中 心 位 置 , 其 顶 平 面 浸 没 在 水 下 2cm。 实 验 时 间 为 1min。 定 向 航 行 实 验 每 天 训 练 4 次 , 每 次 都 改 变 小 鼠 入 水 的 位 置 。 第 1 次 训 练 时 , 无 论 受 试 小 鼠 在 1min 内 能 否 找 到 平 台 , 都 将 小 鼠 放 在 平 台 上 停 留 30s, 使 其 利 用 迷 宫 周 围 提 供 的 标 识 物 学 习 并 辨 别 方 位 。 实 验 记 录 小 鼠 入 水 至 找 到 平 台 的 时 间 即 潜 伏 期 。 空 间 探 索 实 验 时 , 移 走 平 台 , 记 录 小 鼠 在 1min 内 穿 过 原 来 平 台 所 在 位 置 的 次 数 , 只 进 行 一 次 测 试 [5] 。 4.Westernbloting: 行 为 学 实 验 结 束 后 立 即 分 离 海 马 组 织 , 加 入 裂 解 液 , 充 分 匀 浆 。 在 12000g 条 件 下 离 心 30min, 上 清 液 为 总 蛋 白 ; 为 检 测 核 内 Nrf2 表 达 水 平 , 利 用 核 蛋 白 提 取 试 剂 盒 提 取 海 马 组 织 核 蛋 白 ( 参 照 操 作 手 册 )。 用 8% 或 10% 的 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 分 离 蛋 白 后 , 转 至 PVDF 膜 。5% 脱 脂 奶 粉 封 闭 2h, 加 入 antiNrf2(Abcam, 美 国 ) 孵 育 过 夜 。 冲 洗 膜 片 , 加 入 二 抗 。 利 用 化 学 发 光 法 检 测 核 内 Nrf2 蛋 白 表 达 水 平 。 5.RNA 提 取 和 RTPCR: 利 用 Trizol 提 取 海 马 组 织 总 RNA, 各 组 RNAA260/A280 值 均 在 1.8~1.9 之 间 。 逆 转 录 操 作 按 照 Promega 试 剂 盒 说 明 书 操 作 。 PCR 扩 增 条 件 采 用 94℃ 变 性 1min,60℃ 退 火 2min, 72℃ 延 伸 1min, 反 应 30 个 循 环 。HO1 上 游 引 物 :5' CGCCTTCCTGCTCAACATT3' 和 下 游 引 物 :5'TGT GTTCCTCTGTCAGCATCAC3';GCLC 上 游 引 物 :5' TTCCAAGCCTGCAGCATATC3' 和 下 游 引 物 :5' CAGACTCGTTGGCATCATCC3';GCLM 上 游 引 物 : 5'ATGGAGTTCCCAAATCAGCC3' 和 下 游 引 物 :5' ATTGGGTTTTACCTGTGCCC3'。 6. 统 计 处 理 : 所 有 数 据 使 用 SPSS11.0 统 计 软 件 分 析 处 理 , 数 据 以 x±s 表 示 。 潜 伏 期 采 用 重 复 测 量 的 方 差 分 析 (ANOVA); 空 间 探 索 和 蛋 白 表 达 比 较 结 果 采 用 单 因 素 方 差 分 析 , 并 以 LSD 法 进 行 组 间 的 两 两 比 较 。 以 P
中 华 行 为 医 学 与 脑 科 学 杂 志 2012 年 10 月 第 21 卷 第 10 期 ChinJBehavMed&BrainSci,October2012,Vol.21,No.10 ·867· 定 水 平 。 统 计 分 析 (ANOVA) 结 果 显 示 , 正 常 对 照 组 [(9.05±1.37)s] 和 Aβ(421) 模 型 组 [(10.8± 1.38)s] 的 潜 伏 期 差 异 无 统 计 学 意 义 , 但 二 者 较 Aβ(142) 模 型 组 潜 伏 期 [(25.4±3.33)s] 明 显 缩 短 (P
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