第10期 - 中华行为医学与脑科学杂志

中 华 行 为 医 学 与 脑 科 学 杂 志 2012 年 10 月 第 21 卷 第 10 期
ChinJBehavMed&BrainSci,October2012,Vol.21,No.10
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酶 2(COX2) 的 主 要 代 谢 产 物 , 研 究 表 明 ,PGE2 可 影
响 DC 表 型 及 共 刺 激 分 子 的 表 达 , 增 加 IL10、 减 少
IL12 的 产 生 , 抑 制 DC 的 抗 原 提 呈 功 能 。 胶 质 瘤 所 产
生 的 免 疫 逃 逸 是 否 与 PGE2 有 关 尚 不 明 确 。 前 期 研 究
已 证 实 COX2 在 恶 性 胶 质 瘤 组 织 中 具 有 的 表 达 水 平 。
基 于 以 上 研 究 , 推 测 脑 胶 质 瘤 微 环 境 中 高 表 达 COX2
及 由 此 产 生 的 PGE2 可 能 会 影 响 DC 表 型 和 功 能 , 不 能
有 效 地 提 呈 肿 瘤 抗 原 。 而 选 择 性 COX2 抑 制 剂 塞 来
昔 布 阻 断 COX2/PGE2 通 路 或 许 会 改 善 DC 的 抗 原 提
呈 功 能 , 更 好 地 发 挥 抗 肿 瘤 作 用 。
一 、 材 料
材 料 与 方 法
胶 质 瘤 C6 细 胞 株 购 自 上 海 中 国 科 学 院 生 命 科 学
研 究 所 。 主 要 试 剂 : 淋 巴 细 胞 分 离 液 ( 天 津 TBD 生 物
工 程 公 司 ); 重 组 人 粒 细 胞 巨 噬 细 胞 集 落 刺 激 因 子
(rhGMCSF)(Peprotech); 重 组 人 白 细 胞 介 素 4
(rhIL4)(Peprotech);RPMI1640 粉 剂 (Gibco 公 司 ); 鼠
抗 人 单 克 隆 抗 体 CD1a、CD80、CD83、CD86 及 FITC 标
记 兔 抗 鼠 IgG 荧 光 二 抗 (Pharmingen 公 司 );ELISA 试
剂 盒 ( 晶 美 公 司 )。 兔 抗 人 COX2 抗 体 (SantaCruz 公
司 ); 选 择 性 COX2 抑 制 剂 塞 来 昔 布 西 尔 公 司 ( 美 国 );
10% 小 牛 血 清 ( 杭 州 四 季 青 )。
二 、 方 法
1.Westernblot 检 测 : 塞 来 昔 布 作 用 后 C6 细 胞
COX2 表 达 : 取 对 数 生 长 期 的 C6 细 胞 , 制 备 单 细 胞 悬
液 (2×10 5 cels/ml), 按 3ml/ 孔 接 种 于 6 孔 板 , 待 细 胞
贴 壁 后 , 分 别 更 换 含 不 同 浓 度 (0,10,25,50,100
μmol/L) 塞 来 昔 布 的 培 养 基 , 继 续 培 养 48h, 胰 酶 消 化
收 获 各 浓 度 作 用 的 细 胞 , 加 入 200μl 用 冰 预 冷 的 细 胞
裂 解 液 制 备 细 胞 总 蛋 白 ,Bradford 方 法 测 定 蛋 白 质 浓
度 。 取 蛋 白 溶 液 进 行 SDSPAGE 电 泳 分 离 , 将 凝 胶 中
的 蛋 白 电 转 移 到 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 上 ,5% 脱 脂 奶 粉 中 室
温 封 闭 1h, 随 后 加 入 羊 抗 人 COX2 抗 体 、 抗 βactin 抗
体 ,4℃ 孵 育 过 夜 , 用 PBST 洗 3 次 , 加 入 HRP 标 记 的
二 抗 , 室 温 下 孵 育 2h 后 与 A、S 试 剂 室 温 下 孵 育 1.
5h,DAB(0.05%)H 2 O 2 (0.01%) 显 色 , 对 染 色 的 蛋 白
质 谱 带 进 行 扫 描 分 析 读 取 吸 光 度 (A), 计 算 其 与 βac
tin 的 比 值 。
2.ELISA 法 检 测 : 塞 来 昔 布 作 用 C6 细 胞 PGE2 分
泌 水 平 :C6 细 胞 的 制 备 同 Westernblot 实 验 , 不 同 浓 度
(0,10,25,50,100μmol/L) 塞 来 昔 布 作 用 后 , 继 续 培
养 24h, 离 心 提 取 C6 细 胞 上 清 液 , 根 据 ELISA 试 剂 盒
说 明 操 作 , 检 测 各 浓 度 塞 来 昔 布 作 用 后 细 胞 上 清 中
PGE2 水 平 , 每 组 设 3 个 复 孔 , 结 果 取 3 孔 均 值 。
3.C6 细 胞 上 清 液 与 DC 的 共 培 养 : 按 前 述 方 法 培
养 C6 细 胞 , 加 入 含 50μmol/L 塞 来 昔 布 的 培 养 基 继 续
培 养 24h 后 以 1500rpm 离 心 5min, 提 出 细 胞 上 清 液 ,
同 法 提 取 正 常 培 养 C6 细 胞 的 上 清 液 , 过 滤 后 备 用 。
抽 取 健 康 自 愿 者 外 周 血 约 50ml, 无 菌 条 件 下 分 离 获 得
单 个 核 细 胞 ,RPMI1640 培 养 液 调 整 所 获 得 的 单 个 核 细
胞 浓 度 至 2×10 6 /ml, 加 入 50ml 无 菌 培 养 瓶 中 , 放 入
37℃、5%CO 2 培 养 箱 中 , 约 2h 后 可 见 瓶 底 一 层 较 致
密 的 单 核 细 胞 , 说 明 单 核 细 胞 已 经 贴 壁 。 吸 弃 培 养 上
清 , 用 预 热 的 RPMI1640 培 养 液 轻 柔 涤 荡 培 养 瓶 , 进
一 步 去 除 非 贴 壁 细 胞 。 在 培 养 瓶 中 加 入 4ml 完 全 RP
MI1640 培 养 液 , 同 时 加 入 500U/ml 的 白 细 胞 介 素 4
(IL4) 和 100ng/ml 的 粒 细 胞 巨 噬 细 胞 集 落 刺 激 因 子
(GMCSF)。 分 为 三 组 继 续 培 养 ,A 组 正 常 诱 导 组 ,B
组 加 入 C6 细 胞 上 清 液 ,C 组 加 入 塞 来 昔 布 预 处 理 的
C6 细 胞 上 清 液 (50μmol/L 塞 来 昔 布 处 理 C6 细 胞 24h
后 提 取 的 细 胞 培 养 上 清 液 )。 隔 天 半 量 换 液 , 并 在 细
胞 培 养 的 1,3,5,7d 分 别 加 入 500U/ml 的 IL4 和
100ng/ml 的 GMCSF, 利 用 相 差 显 微 镜 观 察 不 同 阶 段
DC 细 胞 形 态 。 于 培 养 第 10 天 收 集 培 养 的 DC。 制 备
细 胞 悬 液 , 低 速 (800rpm×10min) 离 心 浓 缩 , 将 细 胞 悬
液 置 入 1.5ml 的 Ep 管 中 , 以 1500rpm 离 心 10min, 去
除 上 清 , 分 别 以 25% 戊 二 醛 及 1% 锇 酸 后 固 定 , 酒 精 梯
度 脱 水 , 树 脂 包 埋 , 制 备 超 薄 切 片 及 染 色 于 透 射 电 镜 观
察 拍 照 记 录 。
4. 各 组 DC 的 表 型 分 析 : 收 集 培 养 10d 的 DC, 用
PBS 洗 涤 ,1000rpm 离 心 10min 后 弃 上 清 , 边 振 荡 边 加
入 含 1% 多 聚 甲 醛 的 85% 的 乙 醇 混 匀 ,4℃ 固 定 过 夜 。
PBS 洗 涤 2 次 (800rpm×10min), 调 整 细 胞 悬 液 浓 度
至 1×10 6 /ml, 取 100μl 加 入 Ependorf 管 中 , 各 管 中 分
别 加 入 PBS 稀 释 的 鼠 抗 人 CD1a、CD80、CD83、CD86
单 克 隆 抗 体 100μl, 另 一 管 只 加 入 同 体 积 的 PBS 作 为
阴 性 对 照 , 置 于 4℃ 孵 育 2h;PBS 洗 涤 2 次 (800rpm×
10min), 加 入 FITC 标 记 的 兔 抗 鼠 二 抗 100μl/ 管 ,
37℃ 避 光 孵 育 30min。 PBS 洗 涤 2 次 (800rpm ×
10min), 弃 上 清 后 每 管 加 入 PBS500μl, 上 机 检 测 ,
CelQuest 软 件 制 图 分 析 。
5. 混 合 淋 巴 细 胞 反 应 (mixedlymphocytereaction,
MLR): 抽 取 健 康 成 人 外 周 血 10ml, 密 度 梯 度 离 心 分
离 单 个 核 细 胞 , 用 含 10% FCSRPMI1640 养 孵 育 2h,
收 集 悬 浮 细 胞 即 为 同 种 异 体 淋 巴 细 胞 , 调 整 浓 度 为 1
×10 6 /ml 作 为 效 应 细 胞 , 置 于 96 孔 板 ( 每 孔 100μl)。
收 集 各 组 DC, 分 别 加 入 丝 裂 霉 素 C(50μg/ml),37℃
水 浴 30min, 作 为 刺 激 细 胞 。 将 刺 激 细 胞 和 效 应 细 胞
分 别 以 1∶10、1∶25、1∶100 加 入 96 孔 板 中 混 合 培 养 ,
终 体 积 为 200μl, 每 组 设 3 个 复 孔 , 并 分 别 设 空 白 孔 和
单 纯 的 淋 巴 细 胞 对 照 孔 。 在 37℃、5%CO 2 培 养 箱 中
培 养 3d, 于 培 养 结 束 前 4h 加 入 MTT 液 (5mg/ml, 每
孔 20μl), 继 续 孵 育 4h, 离 心 弃 上 清 , 每 孔 加 150μl 二
甲 基 亚 砜 (DMSO), 避 光 , 轻 微 震 荡 10min, 酶 标 仪 测
570nm 波 长 A 值 , 结 果 取 3 孔 均 值 。 以 刺 激 指 数 (
stimulateindex,SI) 代 表 DC 刺 激 T 淋 巴 细 胞 增 殖 能
力 ,SI= 实 验 组 A 值 / 对 照 组 A 值 。