第10期 - 中华行为医学与脑科学杂志

中 华 行 为 医 学 与 脑 科 学 杂 志 2012 年 10 月 第 21 卷 第 10 期
ChinJBehavMed&BrainSci,October2012,Vol.21,No.10
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的 作 用 尚 不 清 楚 。 大 鼠 切 口 痛 模 型 因 可 很 好 模 拟 临 床
术 后 切 口 疼 痛 , 被 广 泛 应 用 于 术 后 切 口 痛 的 研 究 [45] 。
故 本 研 究 建 立 大 鼠 切 口 痛 模 型 , 观 察 ASICs 抑 制 剂
amiloride 局 部 浸 润 对 切 口 痛 大 鼠 痛 行 为 的 影 响 , 并 探
讨 其 可 能 作 用 机 制 , 为 术 后 切 口 痛 的 临 床 治 疗 提 供 实
验 依 据 和 新 思 路 。
一 、 材 料
材 料 与 方 法
1. 实 验 动 物 和 饲 养 : 清 洁 级 成 年 雄 性 Sprague
Dawley(SD) 大 鼠 58 只 , 体 质 量 220250g, 由 徐 州 医 学
院 实 验 动 物 中 心 提 供 。 实 验 前 大 鼠 静 养 1 周 ,12h/12
h 昼 夜 交 替 , 温 度 (23±1)℃, 自 由 进 食 饮 水 。 实 验 动
物 使 用 遵 守 徐 州 医 学 院 实 验 动 物 伦 理 委 员 会 的 相 关 规
定 。
2. 仪 器 和 试 剂 : 七 氟 烷 ( 江 苏 恒 瑞 医 药 有 限 公 司 ,
生 产 批 号 :11062431), 阿 米 洛 利 (amiloride,Sigma 公
司 , 美 国 ), 抗 酸 敏 感 离 子 通 道 3(acidsensingionchan
nel3,ASIC3) 小 鼠 一 抗 (SC2578) 和 FITC 标 记 驴 抗 小
鼠 二 抗 (SC206,Santa 公 司 , 美 国 ), 抗 tERK1/2 小 鼠
一 抗 (SC94)、 抗 pERK1/2 小 鼠 一 抗 (SC32577) 和 碱
性 磷 酸 酶 标 记 马 抗 小 鼠 二 抗 (SC2034,Santa 公 司 , 美
国 ),VonFrey 纤 维 丝 、Model400 热 痛 刺 激 仪 (ITC 公
司 , 美 国 )。
二 、 方 法
1. 实 验 分 组 :58 只 大 鼠 按 随 机 数 字 表 法 选 取 4 只
大 鼠 用 于 足 底 皮 肤 ASIC3 表 达 检 测 ,30 只 用 于 痛 行 为
学 检 测 ,24 只 用 于 Westernblot 检 测 脊 髓 pERK1/2 表
达 , 其 中 痛 行 为 学 检 测 的 30 只 大 鼠 随 机 分 为 3 组 : 对
照 组 (C 组 )、 切 口 痛 组 (I 组 ) 和 amiloride 组 (A 组 ),
每 组 10; 脊 髓 pERK1/2 表 达 检 测 的 24 只 大 鼠 随 机 分
为 3 组 :C 组 、I 组 和 A 组 , 每 组 8 只 。
2. 切 口 痛 模 型 制 备 : 大 鼠 七 氟 醚 吸 入 麻 醉 后 , 碘 伏
[4]
消 毒 右 后 爪 跖 部 , 铺 无 菌 洞 单 , 参 照 文 献 介 绍 的 方
法 制 备 切 口 痛 模 型 : 使 用 手 术 刀 片 从 足 底 近 端 0.5cm
处 向 足 趾 方 向 纵 行 切 开 1cm 的 条 形 切 口 , 切 开 足 底 皮
肤 后 , 用 眼 科 镊 提 起 足 底 肌 肉 并 纵 向 钝 性 分 离 , 保 持 其
起 止 附 着 点 完 整 。 切 口 处 纱 布 压 迫 止 血 , 使 用 50 尼
龙 丝 线 行 褥 式 缝 合 共 2 针 , 手 术 整 个 过 程 持 续 约 5
min, 术 后 肌 注 3 万 IU 青 霉 素 预 防 感 染 。 术 毕 A 组 大
鼠 足 底 切 口 处 amiloride 生 理 盐 水 溶 液 (200μg/20μl)
局 部 浸 润 。
[67]
3. 疼 痛 行 为 学 检 测 : 参 照 文 献 检 测 术 前 24h
及 术 后 2h、4h、8h、12h、24h 大 鼠 机 械 缩 足 阈 值
(PawWithdrawalMechanicalThreshold,PWMT) 和 热 缩
足 潜 伏 期 (PawWithdrawalThermalLatency,PWTL)。
(1)PWMT 检 测 : 将 有 机 玻 璃 箱 置 于 铁 丝 网 格 上 , 大 鼠
置 于 有 机 玻 璃 盒 预 适 应 30min, 以 不 同 力 度 的 Von
Frey 纤 毛 刺 激 大 鼠 足 底 , 按 照 升 序 的 序 列 从 1g 开 始 ,
最 大 刺 激 力 度 为 26g。 以 纤 毛 稍 稍 弯 曲 作 为 完 全 受 力
标 准 , 持 续 刺 激 2s, 连 续 5 次 , 每 次 至 少 间 隔 15s。 若
3 次 不 抬 腿 , 换 高 一 级 克 数 的 纤 毛 ; 有 3 次 抬 腿 , 则 返
回 低 一 级 克 数 的 纤 毛 , 直 到 每 5 次 测 试 中 有 3 次 抬 腿 。
能 够 引 起 3/5 次 抬 腿 的 最 低 VonFrey 纤 毛 的 克 数 计
为 PWMT 值 。(2)PWTL 检 测 : 将 有 机 玻 璃 箱 置 于 3
mm 厚 的 玻 璃 板 上 , 大 鼠 置 于 有 机 玻 璃 盒 预 适 应 30
min, 用 热 辐 射 刺 激 仪 照 射 小 鼠 足 底 , 照 射 开 始 至 小 鼠
出 现 抬 腿 回 避 终 止 , 热 刺 激 强 度 在 整 个 实 验 过 程 中 维
持 一 致 , 自 动 切 断 时 间 为 25s, 连 续 测 定 5 次 , 每 次 至
少 间 隔 5min, 取 后 3 次 平 均 值 计 为 PWTL 值 。
4. 免 疫 荧 光 检 测 大 鼠 足 底 皮 肤 ASIC3 的 表 达 : 大
鼠 在 戊 巴 比 妥 钠 (30mg/kg,i.p.) 深 麻 醉 下 , 经 升 主 动
脉 依 次 灌 注 生 理 盐 水 200ml、4% 多 聚 甲 醛 溶 液 200
ml。 取 足 底 皮 肤 置 于 4% 多 聚 甲 醛 溶 液 中 4℃ 固 定 6h
后 , 转 入 30% 蔗 糖 溶 液 中 4℃ 脱 水 至 组 织 沉 底 。 冰 冻
切 片 , 片 厚 25μm, 切 片 收 集 在 0.01mol/L 磷 酸 盐 缓
冲 液 (PBS) 中 漂 洗 3 次 后 , 封 闭 血 清 封 闭 2h, 加 入 抗
ASIC3 小 鼠 一 抗 (1∶1000),4℃ 孵 育 过 夜 。PBS 漂 洗 3
次 , 加 入 罗 丹 明 标 记 二 抗 ( 驴 抗 小 鼠 IgG,1∶200),37℃
孵 育 2h 后 PBS 冲 洗 3 次 , 暗 室 内 贴 片 ,37℃ 干 片 , 甘
油 封 片 , 荧 光 显 微 镜 摄 片 。
5.Westernblot 检 测 大 鼠 脊 髓 pERK1/2 的 表 达 :
大 鼠 在 戊 巴 比 妥 钠 (30mg/kg,ip) 深 麻 醉 下 断 头 处 死 ,
冰 上 操 作 取 L4L6 脊 髓 腰 骶 膨 大 段 , 将 适 量 组 织 块 置
于 匀 浆 器 中 球 状 部 位 , 按 比 例 加 入 RIPA 裂 解 液 , 冰 上
充 分 匀 浆 、 裂 解 。4℃、12000g 离 心 10min, 取 上 清 液
80μg/40μl 样 本 总 蛋 白 在 10% 的 SDSPAGE 凝 胶 系
统 电 泳 分 离 。 半 干 转 法 将 蛋 白 转 移 至 NC 膜 上 。3%
牛 血 清 封 闭 NC 膜 2h,TBST 漂 洗 3 次 ×10min, 分 别
抗 pERK1/2 小 鼠 一 抗 (1∶500), 抗 tERK1/2 小 鼠 一 抗
(1∶500),4℃ 孵 育 过 夜 ;TBST 漂 洗 3 次 ×10min, 加
入 碱 性 磷 酸 酶 标 记 马 抗 小 鼠 二 抗 (1∶500), 室 温 摇 床
孵 育 2h;TBST 漂 洗 3 次 ×5min, 加 入 NBT/BCIP 显 色
液 , 待 反 应 达 到 要 求 后 , 流 水 洗 涤 终 止 反 应 。 所 得 条 带
经 Photoshop 软 件 进 行 灰 度 分 析 , 以 pERK1/2 和
tERK1/2 条 带 灰 度 值 的 比 值 代 表 蛋 白 表 达 的 相 对 水
平 , 并 以 C 组 比 值 进 行 标 化 后 进 行 统 计 分 析 。
6. 统 计 处 理 : 应 用 SPSS16.0 统 计 学 软 件 进 行 统 计
分 析 。 计 量 资 料 以 x±s 表 示 。 痛 行 为 学 数 据 采 用 重
复 测 量 方 差 分 析 ,Westernblot 数 据 采 用 单 因 素 方 差 分
析 , 两 两 比 较 采 用 q 检 验 , 以 P