54Η εποχή της Φαρμακογενωμικήςνται από στήλη χρωματογραφίας θερμοκρασίας 50−70 0C με σκοπό την τήξη των διπλών ελίκων του DNA. Ηαπαιτούμενη θερμοκρασία είναι τόσο υψηλότερη, όσοπερισσότερα είναι τα ζεύγη G−C, στα οποία σχηματίζο−νται 3 δεσμοί υδρογόνου, έναντι των ζευγών Α−Τ, σταοποία σχηματίζονται 2 μόνον δεσμοί υδρογόνου. Ενσυνεχεία η θερμοκρασία μειώνεται και σχηματίζονταιομοδιμερή της γνωστής DNA ακολουθίας, ομοδιμερήτης μελετώμενης DNA ακολουθίας καθώς και ετεροδι−μερή της γνωστής και της μελετώμενης DNA ακολουθί−ας. Ακολουθεί έκλουση της στήλης με ακετονιτρίλιο. Ταετεροδιμερή στα οποία περιέχεται ο πολυμορφισμόςείναι ασταθέστερα και εκλούονται πρώτα (98).Η νανοτεχνολογία, οι νανοδομές, η ρομποτική καιη βιοπληροφορική (bioinformatics) αποτελούν τη βάσητων μικροσυστοιχιών (microarrays). Οι DNA μικροσυ−στοιχίες επιτρέπουν την ταχεία και παράλληλη μελέ−τη της έκφρασης πολλών γονιδίων (DNA chips, genechips). Σε κάθε μικροσυστοιχία παρατάσσονται σεακριβείς θέσεις DNA ακολουθίες, οι οποίες προκύ−πτουν από PCR (Πανεπιστήμιο Stanford), είτε συντίθε−νται in situ (Affymetrix) και οι οποίες ακινητοποιούνταιμε φωτολιθογραφία. Για τη μελέτη της έκφρασης ενόςγονιδίου το mRNA, που αντιστοιχεί στο συγκεκριμένογονίδιο, μετατρέπεται με τη βοήθεια της αντίστροφηςμεταγραφάσης (reverse transcripase) σε μονόκλωνο συ−μπληρωματικό DNA (comple−mentary DNA, cDNA). Σεκάθε θέση των DNA μικροσυστοιχιών – και υπάρχουνδεκάδες χιλιάδες θέσεις, διαμέτρου 100 nm η κάθε μία−αντιστοιχεί ένα τμήμα γνωστού γονιδίου. Για παρά−δειγμα, μια DNA ακολουθία−δείκτης (probe) μπορεί ναείναι το ολιγονουκλεοτίδιο GTCCTA, που θα αναγνω−ρίσει το συμπληρωματικό του CAGGAT ολιγονουκλεο−τίδιο. Τα probes συνδέονται με ομοιοπολικό δεσμό στοστερεό υπόστρωμα από γυαλί, nylon ή σιλικόνη μετο 5’−άκρο τους, αφήνοντας ελεύθερο το 3’−άκρο. Ταbiochip πρέπει να είναι σταθερά και τα αποτελέσματάτους αναπαραγώγιμα. Για τον εντοπισμό των SNPsχρησιμοποιούνται οι παρακάτω τεχνικές: APEX (ArrayPrimer Extension), ASO (Allele Specific Oligonucleotidehybridization), SBE (Single Base Extension) και ASPE (AlleleSpecific Primer Extension) (99−102).Ο προσδιορισμός των υπαρχουσών ακολουθιώνγίνεται αυτόματα με τη χρήση φθοριζόντων δεικτών,ανοσοβιοαισθητήρων ή ηλεκτροχημικών αισθητήρων.Συνήθως χρησιμοποιείται ένα ζεύγος φθοριζουσώνουσιών (κόκκινο – πράσινο), όπως φλουορεσκεΐνη καιροδαμίνη (495−518 nm και 550−590 nm) ή παράγωγατης κυανίνης Cy3 και Cy5 (650−670 nm), που χρησι−μοποιούνται ως μοριακοί φάροι (molecular beacons).Οι φθορίζοντες δείκτες βρίσκονται στο 3’−άκρο τουprobe και ενεργοποιούνται μόνον αν έχει συνδεθεί ησυμπληρωματική DNA ακολουθία. Για το «διάβασμα»της μικροσυστοιχίας είναι απαραίτητο ειδικό μικρο−σκόπιο και ψηφιακή κάμερα (103−4).Τόσο η κλινική πράξη όσο και η φαρμακευτική βι−ομηχανία επηρεάζονται από την επανάσταση τηςΦαρμακογενωμικής. Όσον αυξάνονται οι γνώσεις μας,τόσο γίνεται σαφέστερο ότι στο μέλλον η αναζήτησηγενετικών πληροφοριών θα είναι μια συνήθης πρακτι−κή. Σκοπός είναι να εντοπιστούν οι SNPs που συνδέο−νται με παθολογικές καταστάσεις. Πώς όμως θα γίνειη σωστή επιλογή τους; Δεν ενδιαφέρουν όλοι οι SNPs,αλλά μόνο όσοι συνδέονται με συγκεκριμένο φαινό−τυπο. Ίσως μάλιστα οι SNPs δεν αρκούν αλλά είναιαπαραίτητο να μελετηθούν και οι απλότυποι.Η πιο σημαντική εφαρμογή της Φαρμακογενωμικήςσήμερα είναι η παροχή εξατομικευμένης φαρμακευτι−κής αγωγής σε όσο δυνατόν περισσότερους ασθενείς.Η χορήγηση ενός φαρμάκου περιλαμβάνει εκτόςτης κλασικής TDM (Therapeutic Drug Monitoring) και τηνφαρμακογενωμική TDM, που ολοκληρώνεται πριν τηνέναρξη της θεραπείας, χωρίς να προηγηθεί αιμολη−ψία και προσφέρει πληροφορίες όχι για ένα αλλά γιαπολλά φάρμακα. Η συνταγή που θα προσκομίζει έναςασθενής θα αποκαλύπτει και το γονότυπό του, σεπερίπτωση που ένα φάρμακο χορηγείται αποκλειστι−κά σε ασθενείς με συγκεκριμένα γενετικά χαρακτηρι−στικά, τα οποία όμως δεν αντιστοιχούν μόνον στονφαρμακολογικό του φαινότυπο, αλλά καθορίζουν καιτον κίνδυνο που διατρέχει ο ασθενής να παρουσιάσεικάποια νοσήματα. Εδώ αναφύονται ηθικά και κοινωνι−κά προβλήματα. Υπερτερεί το δικαίωμα του ασθενούςστην άγνοια ή η υποχρέωσή του στη γνώση και υπόποιες προϋποθέσεις; Πρέπει να διαφυλαχθεί το δικαί−ωμα της μη κοινοποίησης της γενετικής πληροφορίας,η τήρηση της εμπιστευτικότητας και η αποφυγή τουκοινωνικού στιγματισμού.Η αποκάλυψη γενετικών πληροφοριών μπορεί ναεπηρεάσει την προσωπική και την επαγγελματική μαςζωή. Για μια ασφαλιστική εταιρεία ο υποψήφιος προςασφάλιση, που έχει μεγάλη πιθανότητα να νοσήσειαπό κάποιο χρόνιο και δαπανηρό νόσημα, είναι μάλ−λον ανεπιθύμητος. Ο ασφαλιστικός κίνδυνος για κά−ποιον που πιθανόν να νοσήσει από κάποιο χρόνιοκαι δαπανηρό νόσημα, αλλά θα θεραπευτεί, είναι οίδιος με κάποιον άλλο με μικρές πιθανότητες να νοσή−σει από την ίδια ασθένεια αλλά και με μικρές επίσης
ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΑΚΑ ΧΡΟΝΙΚΑ, ΤΟΜΟΣ 72, TEYXOΣ 1−3, 2010 55πιθανότητες να θεραπευτεί από αυτήν. Επομένως τοφαρμακογενωμικό προφίλ αποτελεί σημαντική παρά−μετρο αξιολόγησης των πελατών των ασφαλιστικώνεταιρειών. Τα νέα αυτά επιστημονικά δεδομένα απο−τελούν πρόσφορο έδαφος για την ανάπτυξη προβλη−ματισμών, ηθικών διλλημάτων και αντιπαραθέσεων.Η πολιτεία, η κοινωνία και οι φορείς της και βεβαίωςη επιστημονική κοινότητα καλούνται να πάρουν θέσηστα σοβαρά αυτά προβλήματα (105−7).ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ1. http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/project/journals/journals.html Human Ge−nome Project Sequence Analysis.2. http://www.hapmap.org/ International HapmapProject.3. http://www.sanger.ac.uk/humgen/cnv/ The CopyNumber Variation (CNV) Project.4. http://snp.cshl.org/ The single nucleotide consor−tium.5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/ DbSNP HomePage.6. http://www.nigms.nih.gov/Initiatives/PGRNPharmacogenetics Research Network7. F Vogel. Moderne probleme der humangenetik.Ergeb Inn Med 1959; 12:52−125.8. W Kalow. Familial incidence of low pseudocholin−esterase level. Lancet 1956; 2:576.9. EJ Pantuck. Plasma cholinesterase: gene and varia−tions. Anesth Analg 1993; 77:380−386.10. PE Carson, CL Flangan, CE Ickes, AS Alving. Enzy−matic deficiency in primaquine−sensitive erythro−cytes. Science 1956;124:484−485.11. E Beutler. Study of glucose−6−dehydrogenase: historyand molecular biology. Am J Hematol 1993;42:53−58.12. ΗΒ Ηughes, JP Biehl, AP Jones, LH Schmidt. Me−tabolism of isoniazid in man is related to the oc−currence of peripheral neuritis. Am Rev Tuber 1954;70:266−267.13. RK Donald, FA Sigel, A Venter, DP Parkin et al. Theinfluence of NAT genotype on early bactericidalactivity of isoniazid. Clin Infect Dis 2004; 39:1425−1430.14. M Kinzig−Schippers, D Tomalik−Scharte, A Jetter,B Sheidel et al. Should we use NAT−2 genotypingto personalize isoniazid doses? Anttimicrob AgentsChemother 2005; 49:1733−1738.15. R Weinshilboum. Inheritance and drug response. NEng J Med 2003; 348:529−537.16. a) UA Mayer. Pharmacogenetics: five decades oftherapeutic lessons from genetic diversity. NatRev Genet 2004; 5:669−76. b) Α Γρηγοράτου. Απότη φαρμακογενετική στη φαρμακογενωμική.Φάρμακο: Εργαστηριακή ανάλυση και κλινικήπράξη. Εκπαιδευτικό σεμινάριο Ελληνικής Εται−ρίας Κλινικής Χημείας – Κλινικής Βιοχημείας.Αθήνα 200517. G Tucker. Pharmacogenetics: expectations and re−ality. Br Med J 2004; 329:4−6.18. Meeting report. From human genetic variations topredictions of risks and responses to drugs and theenvironment. Clin Chem Lab Med 2007; 45:427−436.19. Meeting report. Third Santorini conference phar−macogenomics workshop report: pharmacogenom−ics at the crossroads: what else than good sciencewill be needed for the field to become part ofpersonalized medicine? Clin Chem Lab Med 2007;45:843−850.20. E Jacquenoud Sirot, JW van der Velden, K Rentsch,CB Eap, R Baumann. Therapeutic drug monitoringand pharmacogenetic tests as tools in pharmaco−vigilance. Drug Saf 2006;29:735−768.21. P Queneau, B Bannwarth, F Carpentier, JM Guliana,J Bouget, et al. Emergency department visits causedby adverse drug events: Results of a French survey.Drug Saf 2007; 30:81−88.22. V Manolopoulos. Pharmacogenomics and adversedrug reactions in diagnostic and clinical practice.Clin Chem Lab Med 2007; 45:801−814.23. L Alnail. Therapeutic drug monitoring of cancer che−motherapy. J Oncol Pharm Pract 2007; 13:207−221.24. http://www.cypalleles/ki.se Home page of the hu−man cytochrome P450 allele committee.25. D Tomalik−Sharte, A Lazar, U Fuhr, J Kirshheiner.The critical role of genetic polymorphisms in drug−metabolizing enzymes. Pharmacogenom J 2008;8:8−15.26. http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.htmlCytochrome P450 home page.27. JK Lamba,YS Lin, EG Shuetz, KE Thummel. Geneticcontribution to variable human CYP3A−mediatedmetabolism. Adv Drug Deliv Rev 2002; 54:1271−1294.28. LM Mangravite, RM Krauss. Pharmacogenomics ofstatin response. Curr Opin Lipid 2007; 18,409−414.29. a) DA Hesselink, RH van Schaik, IP van derHeiden, M van der Werf et al. Genetic polymor−