ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΑΚΑ ΧΡΟΝΙΚΑ

ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΑΚΑ ΧΡΟΝΙΚΑ, ΤΟΜΟΣ 72, TEYXOΣ 1−3, 2010 67Α. ΔΕΣΜΕΥΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ − ΑΝΟΣΟΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΙΗ εφαρμογή των ανοσολογικών μεθόδων στονπροσδιορισμό της συγκέντρωσης φαρμάκων σε βιο−λογικά υγρά έδωσε μεγάλη ώθηση στην ανάπτυξη τηςTDM. Από το πρώτο αντίσωμα που παρασκευάσθη−κε έναντι της δακτυλίτιδας, σήμερα διαθέτουμε πολύεξειδικευμένα (ακόμη και μονοκλωνικά) αντισώματαέναντι πολλών θεραπευτικών φαρμάκων.Οι κυριότεροι ανοσοπροσδιορισμοί φαρμάκωνβασίζονται στην ακόλουθη αρχή ανταγωνιστικής δέ−σμευσης:D + D−L + Ab (D/Ab) + (D−L/Ab)Όπου:D = το φάρμακο στο δείγμα (συνδέτης),D−L = φάρμακο επισημασμένο με ιχνηθέτη (συνδέ−της),Ab = αντίσωμα ως προς το φάρμακο (δεσμευτής).Το μη επισημασμένο φάρμακο (δηλαδή το φάρ−μακο που υπάρχει στο δείγμα, D) ανταγωνίζεται τοεπισημασμένο (που υπάρχει στο αντιδραστήριο, D−L)για την κατάληψη του περιορισμένου αριθμού θέσε−ων σύνδεσης στο ειδικό αντίσωμα. Έτσι στην ισορ−ροπία της ανοσολογικής αντίδρασης, η συγκέντρωσητου επισημασμένου φαρμάκου, είτε στην ελεύθερη (D−L), είτε στην δεσμευμένη μορφή του (D−L/Ab), εξαρτά−ται από τη συγκέντρωση του φαρμάκου στο δείγμα,μετράται δε με κατάλληλο ανιχνευτή, υπολογίζονταςέτσι με έμμεσο τρόπο την συγκέντρωση του φαρμάκουστο δείγμα.Η διάκριση των ανοσοπροσδιορισμών γίνεται ανά−λογα με τον ιχνηθέτη που χρησιμοποιείται.Οι συχνότερα σήμερα χρησιμοποιούμενοι ανοσο−προσδιορισμοί στην TDM είναι οι FIA και οι EIA. Δυνα−μική ανάπτυξη εμφανίζει επίσης και η CMIA.Οι φθορισμοανοσολογικοί (FIA) προσδιορισμοί,συνδυάζοντας την υψηλή ευαισθησία της φθορισμομε−τρικής ανάλυσης με την υψηλή ειδικότητα των ανοσο−χημικών προσδιορισμών, είναι οι πλέον δημοφιλείς μέ−θοδοι για τους προσδιορισμούς φαρμάκων. Πράγματιορισμένες φθορίζουσες ουσίες μπορούν να ανιχνευ−θούν με φθορισμομετρικό ανιχνευτή σε πολύ χαμηλέςσυγκεντρώσεις (10 −11 έως 10 −12 Μ).Σήμερα, η πλέον διαδεδομένη μέθοδος FIA στηνTDM, είναι η μέθοδος του πολωμένου ανοσοφθορι−σμού (FPIA, Fluorescence Polarization Immunoassay). Ημέθοδος χρησιμοποιεί φθορισμομετρική ανίχνευση σεσυνδυασμό με μέτρηση της πόλωσης του εκπεμπομέ−νου φωτός.Είναι γνωστό ότι, ο βαθμός πόλωσης του φωτόςεκπομπής μιας ουσίας (επισημασμένης με φθορίζονταδείκτη) η οποία διεγέρθηκε με πολωμένο φως εξαρτά−ται από:• τον χρόνο αποδιέγερσης του δείκτη και• την δυνατότητα περιστροφής των μορίων τηςεπισημασμένης ουσίαςΈτσι, κατά την ισορροπία της ανοσολογικής αντί−δρασης, αν η φλουορεσκεΐνη (ο ιχνηθέτης του επισημα−σμένου φαρμάκου) διεγερθεί με πολωμένη ακτινοβολία,τότε ο βαθμός πόλωσης της εκπεμπομένης ακτινοβο−λίας φθορισμού θα εξαρτάται από την συγκέντρωσητου ελεύθερου επισημασμένου (D−F) και του δεσμευμέ−νου με το αντίσωμα (D−F/Ab) φαρμάκου.Το σύμπλοκο (D−F/Ab) έχει πολύ μεγαλύτερο μέ−γεθος σε σχέση με το (D−F) με αποτέλεσμα να πε−ριστρέφεται στο χώρο με πολύ μικρότερη ταχύτητααπό το (D−F). Η ακτινοβολία φθορισμού του συμπλό−κου (D−F/Ab) διατηρεί την πόλωση της ακτινοβολίαςδιέγερσης επειδή πρακτικά το σύμπλοκο είναι ακίνητοστον χώρο. Αντίθετα, η ακτινοβολία φθορισμού τουσυμπλόκου (D−F) χάνει την πόλωση της ακτινοβολί−ας διέγερσης εξ αιτίας της γρήγορης περιστροφήςτου μορίου στο χώρο. Επομένως όταν η συγκέντρωσητου φαρμάκου (D) στο δείγμα είναι μικρή, αυξάνεταιη συγκέντρωση του (D−F/Ab), οπότε παίρνουμε υψη−λές τιμές πολωμένης ακτινοβολίας φθορισμού (P) καιαντιστρόφως.Τα κυριότερα αντιεπιληπτικά καθώς και άλλαφάρμακα (παυσίπονα, κυκλοσπορίνη, θεοφυλλίνη) με−τρώνται σήμερα κυρίως με την μέθοδο αυτή(14).Στους ενζυμοανοσολογικούς (ΕΙΑ) προσδιορισμούςο ιχνηθέτης είναι ένζυμο. Ο προσδιορισμός του φαρ−μάκου βασίζεται στη μέτρηση με κατάλληλο ανιχνευ−τή (κυρίως φωτόμετρο UV−VIS ή φθορισμόμετρο) τουπροϊόντος της ενζυμικής δράσης. Υπάρχουν αρκετέςμέθοδοι ανοσοενζυμικών προσδιορισμών. Οι κυριότε−ρα χρησιμοποιούμενες στην TDM είναι η EMIT (EnzymeMultiplied Immunotechnique) και η ΜΕΙΑ (MicroparticleEnzyme Immunoassay). Η μέθοδος EMIT ήταν από τουςπρώτους ανοσοπροσδιορισμούς που αναπτύχθηκανστην δεκαετία του 70. Η δυνατότητα προσαρμογής τηςσε πολλούς αυτόματους αναλυτές βοήθησε στην ευ−ρεία εξάπλωση της TDM.Μία από τις καλύτερες μεθόδους για τον προσ−διορισμό της δακτυλίτιδας (για λόγους που θα ανα−πτυχθούν παρακάτω) είναι η μέθοδος ΜΕΙΑ. Η τεχνικήMEIA βασίζεται στη χρήση εναιωρήματος μικροσωμα−τιδίων latex επικαλυμμένων με αντίσωμα έναντι τουφαρμάκου. Η μεγάλη ενεργός επιφάνεια των μικροσω−