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Tabella 2 - Sequenza del frammento MADC2. Le regioni sottolineate corrispondono ai primers per l’ottenimento del marcatore SCAR di 391bp, maschio specifico. Table 2 - MADC2 sequence. Underlined regions correspond to the male specific SCAR marker primers. GTGACGTAGG TAGAGTTGAA TAACTAAGCA TGGACCTAAC GATTTCCAAA AGCGTGCGAT TTCTTCTTTC TGCAATTACA TTCTACTATG GAGTGCTAGG GGCAGTTAAT TGAGATTAAA TGCCAGGTTC GATCAAAAGA TCTTTGAACT GCATATCCAT ATATTCTCCA CCCCTATCAA TTCGCAAGAT CTATAAAGTT TTACCCAATT AGTTTTGAGC TAATGCAGGC TATTCCTGAA ACTTTTGAAA CGTTTCAGTG GTCCGCAAAG AAAGAACGTT TGGTCATCTT TCCTTCAAGG CAAGACTTGC GTACAGGTAA TTCACCTAAG ACGATATTTT TCAGTGGACC GTCTCTGGTT AACTTATTGA GTCTCTCATA GCCTACGTCA C ciascun individuo. Gli incroci e l’analisi delle progenie segreganti sono stati invece condotti in serra, in condizioni controllate, su un totale di circa 200 individui. Da ciascuna pianta sono state prelevate alcune foglie giovani ed utilizzate per l’estrazione del DNA. Il DNA genomico è stato estratto secondo il metodo indicato da Taylor e Powell con alcune modifiche minori (Faeti et al., 1996). Per l’analisi RAPD sono stati utilizzati 179 primers decameri appartenenti alle serie A, B, C, D, E, G, H, I, J, disegnati dalla Operon Technologies, USA. Le amplificazioni RAPD ed i profili elettroforetici sono stati ottenuti secondo il protocollo riportato in Faeti et al. (1996). Clonaggio e sequenziamento dei frammenti RAPD. I frammenti RAPD associati putativamente al sesso maschile sono stati eluiti dal gel, clonati e sequenziati secondo la procedura descritta precedentemente (Mandolino et al., 1999). Southern Hybridization. La verifica della sesso-specificità di ciascun frammento è 10 Agroindustria / Aprile 2002 stata effettuata mediante ibridazione di filtri Southern prodotti secondo la procedura già riportata da Mandolino et al. (1999). Produzione di marcatori SCAR. Sulla base della sequenza nucleotidica dei frammenti RAPD, sono stati costruiti dei primers interni alla sequenza per l’ottenimento di marcatori SCAR. Per la produzione dei marcatori SCAR è stato seguito il protocollo dell’analisi RAPD (Faeti et al., 1996) a cui sono state apportate alcune modifiche riguardo la temperatura di annealing (60°C) e la concentrazione di MgCl 2 nella mix di amplificazione (1.5 mM). La verifica dell’associazione del marcatore SCAR al fenotipo è stata effettuata mediante l’analisi di progenie segreganti. Analisi dell’espressione genica mediante la tecnica cDNA AFLP (Amplyfied Fragment Length Polymophism). Materiale vegetale. Semi di canapa della cultivar Fibranova sono stati fatti germinare e mantenuti in serra con un fotoperiodo di 11 ore e ad una temperatura media di 27°C. Figura 2 - Analisi SCAR realizzata con i due primers maschio-specifici, su DNA genomico rispettivamente di maschi e femmine appartenenti a cultivar diverse: Carmagnola (1-2), Fibranova (3-4), Uniko (5-6), Kompolti ibrido TC (7-8), Accessione 2 (9-10), cv. Bialobrzeskie, monoica, quattro individui (11-14). Figure 2 - SCAR analysis with the male-specific primers on genomic DNA from one male and one female of different cultivar: Carmagnola (1-2), Fibranova (3-4), Uniko (5-6), Kompolty Hybrid TC (7-8), Accession 2 (9-10) and four different monoecious plants of cv. Bialobrzeskie (11-14). Molto precocemente è stata realizzata una determinazione rapida del sesso secondo il protocollo di Klimyuk et al. (1993), con alcune modifiche apportate per Cannabis sativa (vedi Risultati). Analisi microscopica della struttura degli apici. Apici maschili e femminili sono stati prelevati in vari momenti del differenziamento sessuale e fissati in glutaraldeide 3% per 24 ore. Successivamente sono stati inclusi in resina ed analizzati al microscopio ottico in sezioni semifini, colorate con Blu di Toluidina. Estrazione del m-RNA. Apici prelevati al 2° nodo ed apici maschili e femminili prelevati al 4° nodo sono stati polverizzati in un mortaio con azoto liquido e trasferiti nel buffer di estrazione (Buffer 1: 50 mM Tris- HCl, pH 9.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2% SDS) scaldato a 37°C (5ml del buffer per 1 g di peso fresco). L’omogenato è stato trasferito in tubi di polipropilene sterili e sottoposto due volte ad estrazione con un egual volume della miscela fenolo/cloroformio/alcool isoamilico (25:24:1), e una volta, con un egual volume della miscela cloroformio/alcool isoamilico (24:1). Al sovranatante ottenuto dall’ultima estrazione è stata aggiunta Oligo-dT cellulosa (Boehringer Mannheim) in quantità pari a 150 mg ml -1 ed NaCl fino ad una concentrazione finale pari a 0.4 M. I campioni sono stati posti in agitazione orizzontale (30-50 rpm) per 30' e quindi centrifugati a bassa velocità per ottenere una completa separazione della cellulosa dal sovranatante. La cellulosa è stata sottoposta a due lavaggi con 10ml di Buffer 2 (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 400 mM NaCl, 0.2% SDS) ed a due lavaggi con 10 ml di Buffer 3 (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl). Ciascun lavaggio è stato seguito da una breve centrifugata a 800xg per 20 minuti. Dopo l’ultimo lavaggio la cellulosa è stata trasferita in colonnine per cromatografia del volume di 10 ml e sottoposta a quattro lavaggi successivi con 10 ml di Buffer 3 per eliminare tutti gli acidi nucleici che non si erano legati per affinità all’OligodT cellulosa. L’RNA messaggero è stato eluito
Tabella 3 - Protocollo per la determinazione rapida del sesso in Cannabis sativa (da Klimyuk et al.,1993 modificato). Table 3 - Procedure for rapid PCR based sex determination. P21 and α 1 primers correspond to the 1-20 and 373-391 position of the MADC2 sequence respectively. Protocollo per la determinazione rapida del sesso in Cannabis sativa (da Klimyuk et al.(1993 ), modificato) 1. Prelevare dalla porzione distale di una giovane foglia un frammento lungo 4-5mm e largo 2-3mm ed introdurlo in una provetta da 1.5ml sterile 2. Aggiungere 40µl di NaOH 0.25M ed effettuare una rapida centrifugata 3. Incubare a 100°C per 35 secondi. netti 4. Aggiungere 40µl di HCl 0.25M e 20µl di Tris-HCl 0.5M, pH 8, 0.25% Triton X-100 5. Centrifugare brevemente ed incubare a 100°C per 2 minuti 6. Prelevare ciascun frammento e trasferirlo sul fondo di una provetta da PCR 7. Aggiungere ad ogni frammento 25µl della MIX di amplificazione MIX H2O 18.3µl Buffer 10X 2.5µl MgCl2 50mM 0.75µl α1 primer (100ng/µl) 1µl P21 primer (100ng/µl) 1µl dNTP mix (2.5mM each) 1.25µl Taq DNA Polymerase (5U/l) 0.2µl Realizzare un'amplificazione per SCAR (vedi Materiali e Metodi) N.B. I primers P21 e α1 corrispondono alle sequenze 1-20 e 373-391 del MADC2 in quattro frazioni ottenute applicando sulla colonnina, per ogni frazione, un volume di 400 µl di Buffer 4 (10 mM Tris-HCl, pH 7.5), scaldato a 65°C. L’RNA messaggero di ciascuna frazione è stato precipitato con 2.5 volumi di etanolo assoluto a -20°C O/N. Le frazioni precipitate sono state recuperate e quantificate spettrofotometricamente. Tutta la procedura del- l’estrazione è stata condotta utilizzando vetreria e supporti monouso sterili, nonché soluzioni prodotte con acqua distillata e DEPC, e successivamente autoclavate. Sintesi del cDNA. Il cDNA è stato sintetizzato a partire da 1µg di mRNA. La sintesi del primo filamento è stata realizzata utilizzando l’enzima Superscript II (Life Technologies), secondo il protocollo sugge- M M M F F F M M F F F F M F M F F M 1Kb 1Kb Figura 3 - Visualizzazione degli amplificati ottenuti con il metodo rapido di determinazione del sesso. La freccia indica la banda relativa al marcatore SCAR maschio-specifico di 391bp. Figure 3 - Amplificate profiles obtained with the rapid methods for sex determination. The arrow indicates the male-specific SCAR marker of 391bp. rito dalla ditta. I’RNA ibrido ha fornito lo stampo per la sintesi del secondo filamento, catalizzata dall’enzima DNA Polymerase I (Life Technologies), in presenza di RNAaseH (Life Technologies). Anche per la sintesi del doppio filamento è stato seguito il protocollo suggerito dalla ditta produttrice dell’enzima. cDNA AFLP. L’analisi cDNA AFLP è stata condotta secondo il protocollo messo a punto da Bachem et al. (1996) utilizzando enzimi di restrizione diversi ed in particolare BstY1 come “rare cutter” ed Mse1 come “frequent cutter”. Le amplificazioni selettive sono state ottenute combinando i due primers BstY +C/+T con 30 primers Mse+3. Gli amplificati sono stati separati su gel di sequenza (poliacrilammide 6% in TBE 0.5X, urea 8 M) realizzato nell’apparato Sequi- Gen GT (Bio Rad). I profili AFLP sono stati rilevati mediante autoradiografia. Analisi Reverse Northern. I frammenti AFLP putativamente differenziali sono stati ritagliati dal gel di sequenza ed eluiti in 50 µl di TE 1X per riscaldamento a 65°C per 15'. Ogni frammento è stato nuovamente amplificato con la combinazione di primers che lo aveva generato, e separato in doppio su gel di agarosio al 1.5%. I frammenti sono stati successivamente trasferiti su filtro di nitrocellulosa (Southern Blotting) in modo tale da avere per ciascuna serie di frammenti, due filtri identici. I filtri sono stati ibridati separatamente con mRNA relativo al 4° nodo maschile e femminile, che era stato precedentemente marcato radioattivamente con α 32 P-dNTP (Sambrook et al., 1989). Per la marcatura interna del mRNA è stato è stato utilizzato come primer l’Oligo-dT (12-18) (Boehringer Mannheim) ed è stato seguito il protocollo suggerito da Sambrook et al. (1989). I pattern di ibridazione sono stati rilevati mediante autoradiografia. Analisi Northern. L’analisi Northern è stata condotta utilizzando 900ng/lane di mRNA relativo al 4° nodo maschile e femminile secondo la procedura riportata in Sambrook, et al. (1989). Le sonde utilizzate sono state marcate radioattivamente (γ 32 P-dNTP) con il metodo della marcatura terminale (Sambrook et al., 1989). RISULTATI E DISCUSSIONE L’analisi RAPD ha permesso di individuare numerosi marcatori polimorfici, rivelando l’elevato grado di polimorfismo esistente tra le varietà e le accessioni di canapa analizzate. Sorprendente è il livello dei marcatori polimorfici (circa 80%) riscontrato tra la varietà Carmagnola e la cultivar Fibranova (entrambe italiane), che invece risultano relativamente poco distanti geneticamente (Allavena, 1961); ciò è tuttavia comprensibile se consideriamo che la canapa è una specie dioica ed allogama obbligata. Dei 179 primers decameri testati, 11 hanno prodotto dei marcatori associati al Agroindustria / Aprile 2002 11
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