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Figura 2 - Distribuzione nei gruppi ARDRA dei
ceppi con attività pectinolitica superiore al
controllo (C. felsineum DSM 794 T ).
Figure 2 - Distribution of the strains with
pectinolytic activity higher than C. felsineum
DSM 794 T in the ARDRA groups.
È stata quindi determinata la sequenza
nucleotidica del 16S rDNA di almeno un rappresentante
di ciascun gruppo ARDRA. Nel
caso del gruppo ARDRA A è stato sequenziato
il 16S rDNA dei due ceppi, L1-6 e
C1-6, impiegati nelle prove di macerazione
in vasca, mentre nel caso del gruppo C è stata
determinata la sequenza nucleotidica del 16S
rDNA di 4 ceppi. Il risultato del confronto
delle sequenze determinate con quelle depositate
in banca dati ha permesso di ricostruire
l’albero filogenetico che mostra la posizione,
Figura 3 - Albero filogenetico basato sul
confronto delle sequenze dei 16S rDNA che
mostra la posizione rispetto ad altre specie di
Clostridium di 5 ceppi pectinolitici
rappresentativi dei 5 gruppi individuati con
l’analisi ARDRA.
Figure 3 - Phylogenetic tree of the 16S rRNA
gene sequences of 5 pectinolytic strains
representing the 5 ARDRA groups and of related
species of Clostridium.
52 Agroindustria / Aprile 2002
rispetto ad altre specie di Clostridium, di
6 ceppi pectinolitici rappresentativi dei
5 gruppi individuati con l’analisi ARDRA
(Fig. 3).
DISCUSSIONE
Per secoli la macerazione biologica in acqua
della canapa è avvenuta ad opera di popolazioni
microbiche naturali, presenti nel
terreno e sulle piante. La macerazione è indubbiamente
il passaggio che più limita la
produzione di filato di canapa. Un’efficiente
produzione su scala industriale richiede
dunque un ammodernamento e un’ottimizzazione
di questa fase, che consentano un
aumento dell’efficienza produttiva e un maggior
controllo sul processo.
L’attività svolta ha riguardato l’isolamento
e la caratterizzazione di ceppi batterici
dotati d’attività pectinolitica elevata. Nella
prima fase del lavoro la ricerca si è concentrata
sui batteri del genere Clostridium che,
almeno nella fase anaerobia del processo in
acqua, rappresentano i principali agenti
degradatori. Prove di laboratorio preliminari
hanno dimostrato che l’impiego dei ceppi
selezionati, dotati di elevata attività di degradazione
dell’acido poligalatturonico,
come inoculi dell’acqua di macerazione, rappresenta
una valida strategia che ha consentito
di diminuire i tempi di macerazione, rispetto
al processo tradizionale, e di migliorare
la qualità della fibra prodotta. L’attività
di degradazione dell’acido poligalatturonico
sembra dunque fornire valide indicazioni
sulle potenzialità macerative degli isolati.
Inoculando nelle vasche, all’inizio del processo,
spore di un ceppo aerobio e di uno
anaerobio selezionati si è riusciti ad accelerare
ulteriormente il processo. Il grado ottimale
di macerazione è stato raggiunto dopo
solo quattro giorni, contro i 12 del controllo
o i 6 della vasca inoculata con il solo ceppo
anaerobio. Poiché la germinazione delle
spore dei ceppi anaerobi richiede l’istaurarsi
di condizioni di anossia nel macero, che si
realizzano solo dopo una fase di accrescimento
di batteri aerobi, possiamo ritenere
che l’inoculo di due ceppi, uno aerobio ed
uno anaerobio, velocizzi il processo rendendolo
in entrambe le fasi indipendente dall’insediamento
della popolazione di degradatori
residente.
In passato la comunità microbica che opera
la macerazione microbiologica in acqua è
stata caratterizzata esclusivamente sulla base
di caratteri fenotipici. In questo modo erano
state caratterizzate solo due specie di batteri
degradatori anaerobi, C. felsineum e C.
acetobutylicum.
La caratterizzazione molecolare degli isolati
pectinolitici anaerobi, condotta in questo
lavoro, ha dimostrato come la comunità
microbica anaerobia, che interviene nella
macerazione in acqua della canapa, sia molto
più complessa. L’analisi ARDRA ha permesso
di suddividere i 120 isolati anaerobi
in 5 gruppi ARDRA. L’86% degli isolati si
colloca all’interno del gruppo ARDRA C,
comprendente anche il 65% degli isolati con
attività elevata. Le sequenze del 16S rDNA
di ceppi appartenenti ad uno stesso gruppo
presentano una similitudine del 99%, confermando
l’elevato grado di relazione
filogenetica tra ceppi di uno stesso ribotipo.
Il sequenziamento del 16S rDNA di almeno
un rappresentante di ciascun gruppo
ha dimostrato che gli isolati, suddivisi in
5 gruppi ARDRA, appartengono ad almeno
4 diverse specie del genere Clostridium
(Fig. 3). Sulla base dell’analisi della sequenza
del 16S rDNA, gli isolati del gruppo C
risultano filogeneticamente distanti dai ceppi
tipo delle specie C. acetobutylicum e C.
felsineum, precedentemente considerate le
uniche specie anaerobie implicate nella macerazione
in acqua. Questi isolati si collocano
invece vicino al ceppo NCP 262, formalmente
appartenente alla specie C.
acetobutylicum, ma attualmente in corso di
riclassificazione come specie distinta,
C. saccharobutylicum (Keis et al., 1995).
Gli isolati appartenenti ai gruppi ARDRA
A e E sono filogeneticamente vicini alle specie
C. acetobutylicum e C. felsineum, due
specie che presentano una elevata relazione
sulla base dell’analisi del marcatore 16S
rDNA (Tamburini et al., 2001). Questi due
gruppi sono composti per la maggior parte
da isolati dotati di attività pectinolitica elevata.
I due rappresentanti del gruppo
ARDRA B, dotati di una bassa attività
pectinolitica, sembrerebbero invece appartenere
ad una nuova specie batterica. La sequenza
del 16S rDNA di uno dei due ceppi
mostra infatti una bassa similitudine con le
sequenze presenti in banca dati.
CONCLUSIONI
L’impiego di tecniche di caratterizzazione
dell’attività pectinolitica e d’identificazione
molecolare della microflora che interviene
nella macerazione in acqua della canapa
si sono dimostrati validi strumenti per
la messa a punto di strategie di miglioramento
e di ottimizzazione del processo tradizionale.
Prove preliminari di laboratorio, condotte
impiegando ceppi selezionati hanno
consentito una riduzione dei tempi di
macerazione e di migliorare la qualità del
prodotto finale. Le condizioni saggiate in
laboratorio possono dunque rappresentare un
punto di partenza per prove di macerazione
su scala più ampia.
BIBLIOGRAFIA
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