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Figura 2 - Distribuzione nei gruppi ARDRA dei ceppi con attività pectinolitica superiore al controllo (C. felsineum DSM 794 T ). Figure 2 - Distribution of the strains with pectinolytic activity higher than C. felsineum DSM 794 T in the ARDRA groups. È stata quindi determinata la sequenza nucleotidica del 16S rDNA di almeno un rappresentante di ciascun gruppo ARDRA. Nel caso del gruppo ARDRA A è stato sequenziato il 16S rDNA dei due ceppi, L1-6 e C1-6, impiegati nelle prove di macerazione in vasca, mentre nel caso del gruppo C è stata determinata la sequenza nucleotidica del 16S rDNA di 4 ceppi. Il risultato del confronto delle sequenze determinate con quelle depositate in banca dati ha permesso di ricostruire l’albero filogenetico che mostra la posizione, Figura 3 - Albero filogenetico basato sul confronto delle sequenze dei 16S rDNA che mostra la posizione rispetto ad altre specie di Clostridium di 5 ceppi pectinolitici rappresentativi dei 5 gruppi individuati con l’analisi ARDRA. Figure 3 - Phylogenetic tree of the 16S rRNA gene sequences of 5 pectinolytic strains representing the 5 ARDRA groups and of related species of Clostridium. 52 Agroindustria / Aprile 2002 rispetto ad altre specie di Clostridium, di 6 ceppi pectinolitici rappresentativi dei 5 gruppi individuati con l’analisi ARDRA (Fig. 3). DISCUSSIONE Per secoli la macerazione biologica in acqua della canapa è avvenuta ad opera di popolazioni microbiche naturali, presenti nel terreno e sulle piante. La macerazione è indubbiamente il passaggio che più limita la produzione di filato di canapa. Un’efficiente produzione su scala industriale richiede dunque un ammodernamento e un’ottimizzazione di questa fase, che consentano un aumento dell’efficienza produttiva e un maggior controllo sul processo. L’attività svolta ha riguardato l’isolamento e la caratterizzazione di ceppi batterici dotati d’attività pectinolitica elevata. Nella prima fase del lavoro la ricerca si è concentrata sui batteri del genere Clostridium che, almeno nella fase anaerobia del processo in acqua, rappresentano i principali agenti degradatori. Prove di laboratorio preliminari hanno dimostrato che l’impiego dei ceppi selezionati, dotati di elevata attività di degradazione dell’acido poligalatturonico, come inoculi dell’acqua di macerazione, rappresenta una valida strategia che ha consentito di diminuire i tempi di macerazione, rispetto al processo tradizionale, e di migliorare la qualità della fibra prodotta. L’attività di degradazione dell’acido poligalatturonico sembra dunque fornire valide indicazioni sulle potenzialità macerative degli isolati. Inoculando nelle vasche, all’inizio del processo, spore di un ceppo aerobio e di uno anaerobio selezionati si è riusciti ad accelerare ulteriormente il processo. Il grado ottimale di macerazione è stato raggiunto dopo solo quattro giorni, contro i 12 del controllo o i 6 della vasca inoculata con il solo ceppo anaerobio. Poiché la germinazione delle spore dei ceppi anaerobi richiede l’istaurarsi di condizioni di anossia nel macero, che si realizzano solo dopo una fase di accrescimento di batteri aerobi, possiamo ritenere che l’inoculo di due ceppi, uno aerobio ed uno anaerobio, velocizzi il processo rendendolo in entrambe le fasi indipendente dall’insediamento della popolazione di degradatori residente. In passato la comunità microbica che opera la macerazione microbiologica in acqua è stata caratterizzata esclusivamente sulla base di caratteri fenotipici. In questo modo erano state caratterizzate solo due specie di batteri degradatori anaerobi, C. felsineum e C. acetobutylicum. La caratterizzazione molecolare degli isolati pectinolitici anaerobi, condotta in questo lavoro, ha dimostrato come la comunità microbica anaerobia, che interviene nella macerazione in acqua della canapa, sia molto più complessa. L’analisi ARDRA ha permesso di suddividere i 120 isolati anaerobi in 5 gruppi ARDRA. L’86% degli isolati si colloca all’interno del gruppo ARDRA C, comprendente anche il 65% degli isolati con attività elevata. Le sequenze del 16S rDNA di ceppi appartenenti ad uno stesso gruppo presentano una similitudine del 99%, confermando l’elevato grado di relazione filogenetica tra ceppi di uno stesso ribotipo. Il sequenziamento del 16S rDNA di almeno un rappresentante di ciascun gruppo ha dimostrato che gli isolati, suddivisi in 5 gruppi ARDRA, appartengono ad almeno 4 diverse specie del genere Clostridium (Fig. 3). Sulla base dell’analisi della sequenza del 16S rDNA, gli isolati del gruppo C risultano filogeneticamente distanti dai ceppi tipo delle specie C. acetobutylicum e C. felsineum, precedentemente considerate le uniche specie anaerobie implicate nella macerazione in acqua. Questi isolati si collocano invece vicino al ceppo NCP 262, formalmente appartenente alla specie C. acetobutylicum, ma attualmente in corso di riclassificazione come specie distinta, C. saccharobutylicum (Keis et al., 1995). Gli isolati appartenenti ai gruppi ARDRA A e E sono filogeneticamente vicini alle specie C. acetobutylicum e C. felsineum, due specie che presentano una elevata relazione sulla base dell’analisi del marcatore 16S rDNA (Tamburini et al., 2001). Questi due gruppi sono composti per la maggior parte da isolati dotati di attività pectinolitica elevata. I due rappresentanti del gruppo ARDRA B, dotati di una bassa attività pectinolitica, sembrerebbero invece appartenere ad una nuova specie batterica. La sequenza del 16S rDNA di uno dei due ceppi mostra infatti una bassa similitudine con le sequenze presenti in banca dati. CONCLUSIONI L’impiego di tecniche di caratterizzazione dell’attività pectinolitica e d’identificazione molecolare della microflora che interviene nella macerazione in acqua della canapa si sono dimostrati validi strumenti per la messa a punto di strategie di miglioramento e di ottimizzazione del processo tradizionale. Prove preliminari di laboratorio, condotte impiegando ceppi selezionati hanno consentito una riduzione dei tempi di macerazione e di migliorare la qualità del prodotto finale. Le condizioni saggiate in laboratorio possono dunque rappresentare un punto di partenza per prove di macerazione su scala più ampia. BIBLIOGRAFIA Di Candilo, M., P. Ranalli, C. Bozzi, B. Focher e G. Mastromei, 2000. Preliminary results of tests facing with the controlled retting of hemp. Industrial Crops and Products 11, 197-203. Donaghy, J.A., P.N. Levett & R.W. 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