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Figura 2 - Mappa molecolare per marcatori RAPD in canapa (varietà Carmagnola). Questa mappa è
stata ottenuta a un valore di LOD = 3.0, massima distanza 30.0. I numeri in corrispondenza dei trattini
sono la sigla identificativa del marcatore RAPD, i numeri fra i trattini esprimono la distanza di mappa
in percentuale di ricombinazione.
Figure 2 - Molecular map of hemp (Carmagnola variety). This map was obtained at LOD = 3.0,
maximum distance 30.0. Numbers next to the hyphens are the RAPD marker code; numbers between
the hyphens indicate the percent of recombination between the markers.
dei 181 loci per i quali è stato ipotizzato il
rapporto di segregazione 1:1 (8.8%), e per
14 dei 46 loci che si presumeva segregassero
secondo il rapporto 3:1 (30.4%). La mappa
più avanzata ottenuta utilizzando il
software MapMaker è quella di Carmagnola,
nella quale finora sono entrati a far parte 66
marcatori distribuiti su 11 gruppi di linkage
(Fig. 2; Cannabis sativa possiede n=10 cromosomi);
la mappa dell’accessione monoica
italiana comprende invece 43 marcatori distribuiti
su 9 gruppi di linkage. Sono attualmente
in corso le analisi delle progenie delle
piante F 2 , con l’obiettivo di costruire una
mappa di linkage fra marcatori RAPD e loci
che controllano il carattere “chemotipo”. I
parentali scelti erano a chemotipo divergente
e praticamente puro (CBD o THC), mentre
tutte le piante F 1 analizzate sono risultate
a chemotipo misto (CBD + THC). Pertanto,
si dovrà esaminare la progenie F 2 per osservare
segregazione del chemotipo e associare
quest’ultimo a qualche marcatore RAPD.
DISCUSSIONE
I risultati presentati confermano ed estendono
precedenti osservazioni (Faeti et al.,
1996) sull’elevato grado di variabilità,
misurabile come polimorfismo molecolare
dei marcatori RAPD, nella specie Cannabis
sativa L. In effetti, tutte le piante esaminate
sono risultate avere un diverso profilo
RAPD, e quindi tutte distinguibili fra loro,
per le bande ottenute dalla combinazione di
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uno o più primers. Questo livello così elevato
di polimorfismo non sorprende dato che
la canapa è un’allogama obbligata, ed è
comparabile con altre specie allogame esaminate,
quali la patata, dove è stato stimato
un polimorfismo del 95% mediante
marcatori RAPD (Gebhardt et al., 1989;
Forapani et al., 1999), Lolium perenne, dove
l’analisi RAPD ha rilevato che la diversità
entro le cv era superiore a quella fra le cv
(Sweeney e Danneberger, 1994) o Medicago
sativa, in cui in alcuni studi il livello di
polimorfismo molecolare RAPD è stato stimato
intorno al 95% (Barcaccia et al., 1994).
Anche i dati relativi al numero di loci sono
compatibili con quanto noto sulla struttura
genetica delle sei varietà esaminate.
Carmagnola e C.S. sono da considerarsi
ecotipi, anche se era da attendersi una base
genetica più ristretta per C.S., che è una selezione
da Carmagnola. Fibranova, invece,
è un incrocio fra l’ecotipo Carmagnola e una
linea di origine russa, la Bredemann Elite, e
questa origine da “cross-bred” si riflette in
un maggior polimorfismo ed una eterozigosi
più elevata. Le due cv Fibrimon e Northern
Lights, pur essendo di origine e caratteristiche
molto diverse (una monoica e contenente
quasi esclusivamente CBD, l’altra dioica e
puro ∆ 9 -THC), condividono una base genetica
molto più ristretta rispetto alle cv italiane,
a causa del lavoro di selezione stretta che
occorre effettuare per impedire la perdita dei
caratteri che le contraddistinguono, il
monoicismo e l’elevato tenore di ∆ 9 -THC,
rispettivamente. Da questo derivano i livelli
più bassi di polimorfismo, di eterozigosi, di
frequenza allelica media, fino ad un più basso
numero di bande individuabili: il lavoro di
scelta e selezione che sta dietro queste cv
provoca la perdita netta di un buon numero
di alleli per la presenza di bande. Quest’ultimo
fenomeno è ancora più marcato nella
linea inbred b92.73.2.13, ottenuta attraverso
due cicli di reversione del sesso ed
autofecondazione. Qui i polimorfismi sono
comparativamente molto ridotti rispetto alle
cv italiane (31% contro circa 80%), c’è un
numero più limitato di alleli per la presenza
di bande, e la frequenza allelica media si
avvicina ad 1, come atteso nel caso di “quasi
fissazione” a molti loci, e l’eterozigosi è
estremamente bassa (Forapani et al., 2001).
Sono stati individuati 3 marcatori RAPD
presenti solo nella cv da droga Northern
Lights e 5 nella linea inbred b92.73.2.13,
entrambe puro THC; questi marcatori risultano
pertanto particolarmente interessanti. Le
analisi statistiche effettuate sono state condotte
su 10 piante di ogni cv, ma sono state
analizzati un numero elevato di loci (102),
il che conferisce validità generale alle conclusioni
tratte (Nei, 1978).
Anche l’analisi di partizione della varianza
osservata riflette in modo fedele la struttura
delle cv analizzate. Comparando coppie di
varietà, si nota che la variabilità fra le varietà
diventa progressivamente più importante
rispetto alla variabilità entro le varietà con
l’aumentare del grado di selezione necessario
a mantenere le caratteristiche delle cv
confrontate. Così, comparando la linea
inbred b92.73.2.13 e la cv da droga Northern
Lights, il 76.3% della variabilità totale delle
due cv è dovuta alla differenza tra cv, mentre
nel confronto tra cv Carmagnola e C.S.,
solo il 12.8% della variabilità è dovuta alle
differenze fra varietà, il resto essendo dovuto
a differenze puramente individuali entro
varietà. Considerando tutte le varietà analizzate,
si ottiene che circa metà della variazione
è dovuta alle differenze tra varietà
(48.8%) e l’altra metà a differenze individuali
(51.2%).Non è stato possibile discriminare
mediante parametri statistici la cv
Carmagnola dalla sua selezione C.S., e anche
la percentuale di variabilità fra queste
due cv (12.8%, tabella 3) è risultata dello
stesso ordine di grandezza della variabilità
di due diversi lotti di seme della cv
Carmagnola, e quindi non significativa (dati
non mostrati). L’elevata percentuale di
varianza dovuta a differenze individuali più
che a segregazione fra le varietà e gli ecotipi
è in accordo con l’ipotesi dell’esistenza di
un’unica specie in Cannabis (Cannabis
sativa), e con l’esistenza di un unico pool
genico per tutta la specie, sottolineata da vari
autori, e indipendente da caratteristiche
macroscopiche come il monoicismo e il tipo
di cannabinoide (de Meijer, 1995; 1999).