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Figura 4 - Sezione longitudinale dell’apice al quarto nodo.
Figure 4 - Longitudinal section of the apex at the fourth node.
fenotipo maschile di dimensioni comprese
tra 400 e 2700bp (Tab. 1). Uno di questi
marcatori, quello generato dal primer
OPA08, è stato clonato e sequenziato
(Mandolino et al., 1998). Il frammento è stato
chiamato MADC2 in accordo con la
nomenclatura proposta da Sakamoto et al.
(1995) ed ha una lunghezza di circa 400bp.
Ha un contenuto di G+C del 40.3% e risulta
privo di ORF al suo interno. Dalla ricerca
nelle banche dati di GenBank, EMBL, DDBJ
e PDB è emerso che questo frammento ha
un basso livello di omologia con altre sequenze
di DNA ripetitivo riscontrate in altre
specie vegetali quali orzo, frumento, cocco,
pino, ed Arabidopsis, inoltre non risulta avere
omologie con il frammento MADC1 identificato
da Sakamoto et al. (1995), nonostante
la forte similitudine nel contenuto di G+C
(39.9% in MADC1 e 40.3% in MADC2).
La maschio-specificità del MADC2 è stata
testata mediante una ibridazione Southern
che ha rivelato tuttavia la presenza del frammento
sia nel genoma maschile che femmi-
Figura 5 - Sezione longitudinale dell’apice al secondo nodo.
Figure 5 - Longitudinal section of the apex at the second node.
12 Agroindustria / Aprile 2002
nile (Mandolino et al., 1999).
Sulla base della sequenza MADC2
(Tab. 2) sono stati costruiti due primers, rispettivamente
corrispondenti alle posizioni
1-20 (5'-GTGACGTAGGTAGAGTTGAA-3')
e 373-391 (5'-GTGACGTAGGCTATGAGAGA-3')
del frammento. Questi primers hanno permesso
di amplificare una regione di 391bp
nel genoma maschile e due regioni, di circa
560bp e 870bp, nel genoma degli individui
di sesso femminile e monoici. La capacità
del marcatore SCAR di 391bp di individuare
il fenotipo maschile è stata inizialmente
verificata su 41 individui di sesso maschile,
femminile e monoico, appartenenti a 20 varietà
ed accessioni diverse di canapa
(Mandolino et al., 1998). In tutti i maschi
analizzati è stata prodotta un unica banda di
391bp mentre nelle femmine e nei monoici
sono state prodotte le due bande di peso
molecolare maggiore (Fig 2). L’analisi di tre
progenie segreganti per il sesso ha permesso
di confermare l’associazione del
marcatore di 391bp al sesso maschile in
quanto in nessun caso è stato possibile riscontrare
ricombinazione per il marcatore.
Questo permette di dire che il frammento di
391bp costituisce un marcatore molecolare
affidabile per l’identificazione del sesso maschile.
La produzione dei due frammenti di
560bp ed 870bp negli individui di sesso femminile
e nei monoici da parte dei primers
SCAR, nonché il risultato dell’analisi
Southern, confermerebbe la presenza di sequenze
simili nel genoma maschile e femminile.
Evidentemente, però tali sequenze
risultano organizzate in maniera diversa nei
due sessi. È ormai ampiamente accettata la
teoria secondo cui i cromosomi sessuali X e
Y si sarebbero originati da una coppia di cromosomi
omologhi attraverso l’instaurazione
di un meccanismo di repressione della
ricombinazione, che avrebbe portato i due
cromosomi a differenziarsi anche
morfologicamente (Charlesworth, 1991).
D’altro canto l’assenza di ricombinazione
avrebbe favorito l’accumulo di sequenze ripetute
di cui i cromosomi sessuali vegetali
sono particolarmente ricchi (Charlesworth,
1991). L’assenza di ricombinazione per il
marcatore di 391bp fa pensare che esso si
trovi sul cromosoma Y, e benché non esista
una dimostrazione diretta di ciò, questa ipotesi
potrebbe essere comunque avvalorata
dall’omologia esistente tra la sequenza del
frammento SCAR e le sequenze riscontrate
in regioni di DNA ripetitivo di altri organismi
vegetali. Sulla base di questi dati
possiamo dire che i nostri primers SCAR
sono in grado di amplificare frammenti di
DNA ripetuto presenti probabilmente nella
regione di “non ricombinazione” dei due
cromosomi sessuali e che per questo motivo,
nel tempo, hanno acquisito una diversa
organizzazione. La probabile localizzazione
dei due frammenti di 560bp ed 870bp
sul cromosoma X potrebbe essere dimostrata
dalla possibilità di ottenere la loro amplificazione
anche negli individui di sesso
maschile, in opportune condizioni (minore
stringenza).
Accertata l’associazione tra il marcatore
di 391bp ed il sesso maschile, si è cercato di
produrre un sistema che permettesse una
determinazione rapida ed affidabile del sesso,
basato sulla presenza-assenza di questo
marcatore. Sulla base di un protocollo modellato
su Arabidopsis da Klimyuk et al.
(1993), apportando le dovute modifiche per
Cannabis, è stato messo a punto un sistema
rapido di screening del sesso che consiste
nella realizzazione di una amplificazione
PCR direttamente su tessuto vegetale opportunamente
trattato (Tab. 3, Fig. 3). La possibilità
di determinazione del sesso nella canapa
mediante lo SCAR rapido non solo
costituisce uno strumento utile al miglioramento
genetico ma ha avuto un ruolo fondamentale
anche nel lavoro di ricerca finalizzato
all’identificazione dei geni coinvolti nel
differenziamento sessuale di Cannabis