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Tabella 3 - Risultati di prove di laboratorio di macerazione. L’acqua delle vasche è stata inoculata con
spore di ceppi di Clostridium selezionati.
Table 3 - Retting in laboratory tanks, supplemented with different Clostridium strains.
Tipo di
macerazione
L1-6
Temperatura
dell’acqua (°C)
Tempo di
macerazione
(giorni)
liquide cresciute a 37°C e in condizioni
d’anaerobiosi, per tre giorni in terreno massimo
contenente 0.5% di pectina. Indagini
condotte su miscele enzimatiche di varie
composizioni sembrano dimostrare come la
capacità macerativa sia correlata con l’attività
di degradazione della componente non
metilata della pectina (Zhang et al., 2000).
L’attività di degradazione dell’acido poligalatturonico
potrebbe dunque fornire indicazioni
sulle potenzialità macerative dei ceppi
isolati. Questa analisi ha consentito di identificare
26 ceppi dotati di attività pectinolitica
superiore al controllo, il ceppo tipo di collezione
della specie C. felsineum DSM 794 T
(Tab. 2), (Mastromei et al., 2001).
Prove di laboratorio di macerazione con
inoculi di ceppi anaerobi. Sono state allestite
prove preliminari di laboratorio di
macerazione in acqua; all’inizio del processo,
l’acqua di ognuna delle vasca è stata inoculata
con uno dei ceppi anaerobi selezionati,
dotati di attività pectinolitica superiore
al controllo C. felsineum DSM 794 T . Al termine
della macerazione le fibre sono state
separate dagli steli manualmente e sottoposte
a determinazione delle proprietà morfologiche,
e fisiche.
Tra gli 11 ceppi batterici saggiati, due ceppi,
L1-6 e C1-6, hanno fornito i migliori risultati.
Nonostante la temperatura piuttosto
bassa dell’acqua delle vasche (20°C), il grado
ottimale di macerazione è stato ottenuto
in soli 6 giorni, contro i 12 del controllo
(Tab. 3). Nel caso degli altri ceppi analizzati
il grado ottimale di macerazione veniva raggiunto
in tempi superiori rispetto ai ceppi
L1-6 e C1-6, ma sempre inferiori rispetto al
controllo. Oltre a accelerare il processo, dimezzandone
la durata, i due ceppi con capacità
macerativa maggiore hanno prodotto
una fibra di qualità superiore rispetto al
Sofficità delle
fibre (S) a
Finezza delle
fibre (g m -1 )
Colore delle
fibre
20.2 6 5.0 0.030 Bianco
argentato
C1-6
20.1 6 5.0 0.037
Bianco
argentato
Controllo
a
Analisi visiva (1-5).
20.2 12 4.0 0.062 Grigio
controllo, più soffice, più sottile e di colore
chiaro (Tab. 3), (Di Candilo et al., 2000).
Isolamento di ceppi pectinolitici aerobi.
L’inoculo delle vasche con ceppi anaerobi
selezionati consente di diminuire i tempi di
macerazione e aumentare la qualità del prodotto.
Tuttavia la germinazione delle spore
dei ceppi anaerobi richiede l’istaurarsi di
condizioni di anaerobiosi nel macero, che si
realizzano solo dopo una fase di accrescimento
di batteri aerobi. La selezione di ceppi
aerobi, dotati di attività pectinolitica elevata,
potrebbe permettere un ulteriore miglioramento
e accelerazione del processo.
L’impiego combinato di ceppi (aerobi e/o
anaerobi), opportunamente selezionati, potrebbe
permettere di ottenere un miglior controllo
sul processo e una qualità della fibra
più uniforme.
Da campioni d’acqua di macerazione di
canapa provenienti da maceri con diversa
localizzazione geografica (Tab. 4) sono stati
isolati un totale di 123 ceppi. Tra gli isolati
sono stati individuati 25 ceppi pectinolitici,
mediante saggio enzimatico su piastra. Per
tutti i ceppi pectinolitici aerobi è stata misurata
l’attività di degradazione dell’acido
poligalatturonico sui sopranatanti di colture
liquide cresciute per due giorni a 30°C in
terreno massimo contenente 0.5% di pectina.
Tra tutti i ceppi isolati il ceppo ROO-2A si è
dimostrato quello dotato di attività
pectinolitica maggiore. La determinazione
della sequenza parziale del 16S rDNA ha
permesso di attribuire il ceppo ROO-2A al
genere Bacillus.
Prove di laboratorio di macerazione di
canapa con inoculi di ceppi aerobi ed
anaerobi. Sono state allestite prove di laboratorio
di macerazione in vasca in modo da
confrontare quattro diverse condizioni di
macerazione; all’inizio della macerazione
Tabella 4 - Ceppi aerobi isolati da acqua di maceri di diversa provenienza.
Table 4 - Aerobic strains isolated from retting tank water from different areas.
Provenienza N° Ceppi isolati Ceppi con attività
pectinolitica
Nadlac, Romania 67 18
Nagylak, Ungheria 56 7
TOTALE 123 25
sono state inoculate nell’acqua delle vasche
spore di un ceppo anaerobio (L1-6 o C1-6)
oppure di un ceppo aerobio (ROO-2A) e di
un ceppo anaerobio (L1-6). Nella terza vasca
sono state mantenute condizioni di
areazione per tutto il processo e l’acqua della
vasca è stata inoculata con spore del ceppo
aerobio ROO-2A. Il controllo dell’esperimento
è consistito in una vasca senza alcun
inoculo in cui si è operata una
macerazione tradizionale.
Non è stato rivelata alcuna accelerazione
della macerazione, rispetto alla vasca di controllo,
quando il processo è stato effettuato
in condizioni di areazione continua e inoculo
di un ceppo aerobio. La fibra ottenuta è
inoltre risultata scadente presentando, al termine
del processo, una vistosa colorazione
bruna. I migliori risultati sono stati ottenuti
con l’inoculo combinato di un aerobio e di
uno anaerobio; in queste condizioni il grado
ottimale di macerazione è stato raggiunto
dopo solo quattro giorni, contro i 12 del controllo
o i 6 della vasca inoculata con il solo
ceppo anaerobio.
Caratterizzazione molecolare dei ceppi
anaerobi pectinolitici. I 122 ceppi anaerobi
pectinolitici isolati sono stati caratterizzati
mediante ARDRA. L’ARDRA è una metodica
rapida e riproducibile che consente la
tipizzazione di ceppi batterici, ovvero permette
di suddividere degli isolati batterici in
più gruppi omogenei, che spesso corrispondono
a specie batteriche (Vaneechoutte et al.,
1992).
L’analisi ARDRA con gli enzimi di restrizione
Alu I, Rsa I e Hinf I ha consentito di
suddividere i 120 isolati in 5 gruppi, ciascuno
contenente isolati con lo stesso profilo
con i tre enzimi (Fig. 1). Il gruppo ARDRA
C è risultato essere il più popolato raccogliendo
l’86% degli isolati. I 26 ceppi dotati
di attività pectinolitica superiore al controllo
(> 0.03 U.I. mg -1 di cellule) sono stati raggruppati
in 3 gruppi ARDRA (Fig. 2).
Figura 1 - Distribuzione dei ceppi pectinolitici
nei gruppi ARDRA.
Figure 1 - Distribution of the pectinolytic
strains in the 5 ARDRA groups.
Agroindustria / Aprile 2002 51