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Identificazione di marcatori molecolari associati al sesso e loro applicazione al breeding ed allo studio del differenziamento sessuale di Cannabis sativa L. V.M.Cristiana Moliterni, Giuseppe Mandolino, Luigi Cattivelli 1 , Paolo Ranalli. Istituto Sperimentale per le Colture Industriali, Via di Corticella, 133 (BO) 1 Istituto Sperimentale per la Cerealicoltura, Strada S. Protaso, 302 - Fiorenzuola d’Arda (PC) RIASSUNTO La Cannabis sativa è una specie dioica con dimorfismo sessuale che si manifesta in una fase molto tardiva dello sviluppo, poco prima della produzione dei fiori. Di qui la necessità di un sistema rapido di discriminazione dei due sessi, funzionale alla realizzazione dei programmi di breeding. L’analisi RAPD del genoma di individui di sesso maschile e femminile ha permesso di individuare alcuni frammenti di DNA maschio-specifici. Da uno di questi, il MADC2, è stato ottenuto un marcatore SCAR che consente una discriminazione rapida e sicura dei due sessi. Tale marcatore è stato inoltre un supporto utile allo studio del differenziamento sessuale di Cannabis sativa. Parole chiave: Cannabis sativa, dioicismo, differenziamento sessuale, RAPD, SCAR, marcatori del sesso, C-DNA AFLP. ABSTRACT Sex-linked molecular markers as tools for breeding and studies on sexual differentiation of Cannabis sativa L. Cannabis sativa L. is a naturally dioecious species with heterogametic males (2n = 18+XY) and homogametic females (2n = 18+XX). It is characterized by unisexual flowers and shows sexual dimorphism. Despite the presence of sexual chromosomes, the sex of Cannabis sometimes shows some flexibility. Anomalies may in fact occur in floral development, such as the presence of the reproductive structure of the opposite sex or the development of bisexual inflorescence (monoecious phenotype). Sexual dimorphism generally occurs late in plant development, often leading to labourintensive steps during breeding programs. The development of a method for rapid sex determination in Cannabis sativa would therefore be advisable. By means of the RAPD technique, applied to male and female genomes, a marker of 400bp was identified to be male specific. It was named MADC2 (Male Associated DNA of Cannabis) according to Sakamoto et al. (1995). Despite its sex-specific association, the sequences corresponding to MADC2 were present in both staminate and carpellate plants, as revealed by Southern hybridization with the cloned RAPD band. MADC2 was sequenced and specific primers were constructed corresponding to its 1-20 and 373-391 positions. These primers generated a male-specific SCAR marker, 391bp long, and two fragments about 560 and 870bp long in the female and monoecious genotypes. A rapid method based on a PCR amplification directly from plant tissue was also developed from the original protocol by Klimyuk et al. (1993). This procedure, with the male-specific SCAR marker, gives a suitable method for a precise, early and rapid identification of males during breeding programs. The molecular mechanism of Cannabis sativa sexual differentiation was also investigated. By means of optical microscopy, the earliest step in apex sexual differentiation was identified as the leaves of the fourth node emerge. Most of the samples observed at this stage have indeed developed some lateral meristem buds. In order to identify the genes involved in this earliest stage of sexual differentiation an analysis of gene expression was carried out by means of the cDNA AFLP technique. Several differentially expressed AFLP fragments were recovered and their sex specificity checked by Reverse Northern and Northern analysis, but only subcloning and sequencing will make it possible to track back to the genes having a differential expression at this stage. The rapid method of sex determination was of great importance for sex discrimination at the fourth node, because of the complete absence of sexual dimorphism between plants at this stage. Key words: Cannabis sativa, dioecy, sexual differentiation, RAPD, SCAR, sex linked molecular markers, cDNA AFLP. INTRODUZIONE La Cannabis sativa è una pianta erbacea annuale appartenente alla famiglia delle Cannabaceae e all’ordine delle Hurticales. Autore corrispondente: V.M.Cristiana Moliterni Istituto Sperimentale Colture Industriali, Via di Corticella, 133 - 40128 Bologna, Italia Tel. (051) 6316811 - Fax (051) 374857. Lavoro svolto con finanziamento MiPAF nell’ambito del Progetto “Canapa per fibra tessile: dalla produzione alla utilizzazione”. 8 Agroindustria / Aprile 2002 È una specie naturalmente dioica, con individui di sesso maschile e femminile, dotati di fiori unisessuali e caratterizzati da un dimorfismo sessuale che, oltre alla morfologia del fiore, si estende anche all’habitus della pianta. Infatti i maschi sono generalmente più alti ed esili delle femmine ed hanno un ciclo vitale più breve. I fiori unisessuali sono portati in infiorescenze dapprima terminali e successivamente laterali (Fig. 1). Negli individui di sesso maschile i fiori sono organizzati in numero variabile in panicoli pendenti ed a volte ramificati, generalmente privi di foglie. I fiori del panicolo possono essere singoli o raggruppati ed in questo caso ogni fiore è sostenuto da un sottile peduncolo. Ogni fiore maschile è costituito da un perianzio formato da cinque sepali che racchiude l’androceo composto da cinque stami sostenuti da sottili filamenti. Le antere portate all’estremità degli stami, a maturità deiscono longitudinalmente liberando il polline che può essere così trasportato dal vento (Mohan Rham & Nath, 1964). I fiori femminili sono invece organizzati in racemi che si sviluppano in posizione terminale od all’ascella di foglie o ramificazioni laterali. Nell’infiorescenza, all’ascella di una piccola foglia verde si sviluppano due fiori ciascuno sotteso ad una piccola stipola. Il fiore femminile ha una struttura molto semplice essendo costituito da una brattea verde che avvolge completamente il perianzio, appena abbozzato, e l’ovario. Lo stilo si differenzia nella porzione distale in uno stimma bifido. La brattea fiorale è particolarmente ricca di peli silicei e tricomi ghiandolari che secernono sostanze aromatiche e resinose (Mohan Rham & Nath, 1964). Il corredo cromosomico di Cannabis sativa è composto da 9 coppie di autosomi ed una coppia di cromosomi sessuali. Il sesso maschile è definito dalla presenza della coppia eteromorfa XY mentre quello femminile è definito dalla coppia XX, similmente a quanto si verifica in altre specie dioiche come per esempio la Silene latifolia. Il cromosoma Y in Cannabis è subtelocentrico ed è caratterizzato dall’avere un satellite all’estremità del braccio corto ed un braccio lungo particolarmente sviluppato, tanto che si ritiene che la differenza nelle dimensioni dei genomi maschile e femminile (rispettivamente 1683 Mbp e 1636 Mbp), sia quasi completamente attribuibile al cromosoma Y (Sakamoto et al., 1998). Il cromosoma X invece è submetacentrico e porta un satellite all’estremità del braccio corto. Come si verifica frequentemente nei cromosomi sessuali vegetali, anche il cromosoma Y di Cannabis è fortemente eterocromatico e ricco di sequenze ripetute che sono causa della sua forte condensazione in metafase (Sakamoto et al., 1998). Una buona parte del DNA ripetuto è costituito da sequenze del tipo LINE (Long Interspersed Elements) che rappresentano vestigia di elementi trasponibili al livello dei quali è possibile rilevare un basso livello di trascrizione per
Tabella 1 - Frammenti RAPD maschio specifici. Table 1 - Male specific RAPD markers. Primer Sequenza Dimensioni della banda RAPD OPA08 5’-GTGACGTAGG-3’ 400 bp OPA12 5’-TCGGCGATAG-3’ 700 bp OPC04 5’-CCGCATCTAC-3’ 1600 bp OPC08 5’-TGGACCGGTG-3’ 2700 bp OPC10 5’-TGTCTGGGTG-3’ 700 bp OPC14 5’-TGCGTGCTTG-3’ 1400 bp OPD05 5’-TGAGCGGACA-3’ 900 bp OPE02 5’-GGTGCGGGAA-3’ 1000 bp OPE14 5’-TGCGGCTGAG-3’ 400 bp OPI01 5’-ACCTGGACAC-3’ 1600 bp OPJ16 5’-CTGCTTAGGG-3’ 1400 bp la presenza di ORF ancora attive, relative ad enzimi connessi al meccanismo stesso della trasposizione. Le LINEs di Cannabis sativa (LINE-CS) sono rappresentate anche negli autosomi e nel cromosoma X ma, molto particolare è la loro specifica concentrazione all’estremità del cromosoma Y. Ciò fa pensare che esse possano avere un ruolo nel mantenimento della struttura dell’Y e che possano contribuire alla differenziazione morfologica e strutturale dei cromosomi sessuali creando delle regioni eteromorfiche al livello delle quali risulta repressa la ricombinazione (Sakamoto et al., 2000). Nonostante siano presenti i cromosomi sessuali, il sesso nella canapa è un carattere che manifesta una certa flessibilità. Infatti occasionalmente è possibile rilevare delle anomalie nello sviluppo fiorale che si manifestano con la comparsa degli organi ripro- Figura 1 - Infiorescenza maschile (sinistra), infiorescenza femminile (destra). Figure 1 - Male inflorescence (left), female inflorescence (right). duttivi del sesso opposto o con lo sviluppo di infiorescenze miste (recanti sia fiori maschili che femminili) che caratterizzano il fenotipo monoico. Un altro aspetto controverso della determinazione del sesso in Cannabis è dato dalla possibilità di ottenere per alcuni genotipi, la sua parziale o completa reversione. È noto infatti che il trattamento con sostanze mascolinizzanti o femminilizzanti, seguito dall’esposizione ad un fotoperiodo efficace per l’induzione alla fioritura, è in grado di determinare la comparsa degli organi riproduttivi del sesso opposto anche in individui che sono già in uno stadio avanzato del proprio differenziamento sessuale. Hanno un effetto mascolinizzante quelle sostanze che inibiscono la biosintesi o l’attività dell’etilene quali l’aminoetossi- 3- vinilglicina, Ag(S O ) e AgNO3 , mentre 2 3 2 hanno un effetto femminilizzante i precur- sori o gli attivatori della biosintesi di questo ormone vegetale come l’etephon (Mohan Ram and Sett, 1982a; Mohan Ram and Sett, 1982b). La possibilità di reversione è sicuramente un carattere a base genetica poiché esistono dei genotipi suscettibili e dei genotipi refrattari al trattamento di reversione. In pieno campo il ciclo vitale della canapa ha una durata di 5-6 mesi ed il raggiungimento della maturità sessuale si verifica dopo 3-4 mesi con la comparsa dei fiori unisessuali. Il dimorfismo sessuale si manifesta solo in uno stadio molto avanzato dello sviluppo quando, poco prima della produzione dei fiori, negli individui di sesso maschile si verifica un particolare allungamento degli ultimi internodi, fenomeno che rende i maschi più alti ed esili delle femmine. La possibilità di distinzione precoce del sesso costituisce un problema basilare in ogni programma di miglioramento genetico della canapa, essendo questa una specie tipicamente allogama. Per esempio, il metodo Bredeman di selezione per la qualità della fibra prevede un’analisi precoce qualitativa e quantitativa della fibra negli individui di sesso maschile, cui segue l’eliminazione e quindi l’esclusione dalla possibilità di impollinazione di quelli che non soddisfano i parametri stabiliti (Bredeman, 1938). L’obiettivo principale di questo lavoro è stato quindi la ricerca di un sistema che permettesse una discriminazione precoce ed affidabile dei due sessi e che potesse costituire un supporto utile ai programmi di miglioramento genetico di Cannabis sativa. L’altro aspetto investigato ha riguardato più direttamente il meccanismo di determinazione del sesso. Sebbene sia conosciuta la relazione tra cromosomi eteromorfici e sesso in Cannabis, nulla è ancora noto sui meccanismi molecolari che sottendono a questo processo. Il lavoro di ricerca si è quindi sviluppato da un lato verso l’analisi dei genomi di individui di sesso maschile e femminile, mediante la tecnica RAPD (Williams et al., 1990), al fine di identificare sequenze di DNA sesso-specifiche; e dall’altro verso la comprensione dei meccanismi molecolari del differenziamento sessuale in Cannabis. A tale scopo è stata condotta un’analisi dell’espressione genica differenziale, utilizzando la tecnica cDNA AFLP. MATERIALI E METODI Analisi dei genomi mediante la tecnica RAPD (Random Amplyfied Polymorphic DNA). Semi appartenenti a 13 varietà ed accessioni di Cannabis sativa, di diversa origine (Faeti et al., 1996), sono stati fatti germinare in serra e le plantule sviluppatesi sono state trasferite in pieno campo fino al raggiungimento della maturità sessuale, al fine di identificare con certezza il sesso di Agroindustria / Aprile 2002 9
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