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Tabella 1 - Frammenti RAPD maschio specifici.
Table 1 - Male specific RAPD markers.
Primer Sequenza
Dimensioni
della banda
RAPD
OPA08 5’-GTGACGTAGG-3’ 400 bp
OPA12 5’-TCGGCGATAG-3’ 700 bp
OPC04 5’-CCGCATCTAC-3’ 1600 bp
OPC08 5’-TGGACCGGTG-3’ 2700 bp
OPC10 5’-TGTCTGGGTG-3’ 700 bp
OPC14 5’-TGCGTGCTTG-3’ 1400 bp
OPD05 5’-TGAGCGGACA-3’ 900 bp
OPE02 5’-GGTGCGGGAA-3’ 1000 bp
OPE14 5’-TGCGGCTGAG-3’ 400 bp
OPI01 5’-ACCTGGACAC-3’ 1600 bp
OPJ16 5’-CTGCTTAGGG-3’ 1400 bp
la presenza di ORF ancora attive, relative
ad enzimi connessi al meccanismo stesso
della trasposizione. Le LINEs di Cannabis
sativa (LINE-CS) sono rappresentate anche
negli autosomi e nel cromosoma X ma, molto
particolare è la loro specifica concentrazione
all’estremità del cromosoma Y. Ciò fa
pensare che esse possano avere un ruolo nel
mantenimento della struttura dell’Y e che
possano contribuire alla differenziazione
morfologica e strutturale dei cromosomi sessuali
creando delle regioni eteromorfiche al
livello delle quali risulta repressa la
ricombinazione (Sakamoto et al., 2000).
Nonostante siano presenti i cromosomi
sessuali, il sesso nella canapa è un carattere
che manifesta una certa flessibilità. Infatti
occasionalmente è possibile rilevare delle
anomalie nello sviluppo fiorale che si manifestano
con la comparsa degli organi ripro-
Figura 1 - Infiorescenza maschile (sinistra), infiorescenza femminile (destra).
Figure 1 - Male inflorescence (left), female inflorescence (right).
duttivi del sesso opposto o con lo sviluppo
di infiorescenze miste (recanti sia fiori maschili
che femminili) che caratterizzano il
fenotipo monoico. Un altro aspetto controverso
della determinazione del sesso in
Cannabis è dato dalla possibilità di ottenere
per alcuni genotipi, la sua parziale o completa
reversione. È noto infatti che il trattamento
con sostanze mascolinizzanti o
femminilizzanti, seguito dall’esposizione ad
un fotoperiodo efficace per l’induzione alla
fioritura, è in grado di determinare la comparsa
degli organi riproduttivi del sesso opposto
anche in individui che sono già in uno
stadio avanzato del proprio differenziamento
sessuale. Hanno un effetto mascolinizzante
quelle sostanze che inibiscono la biosintesi
o l’attività dell’etilene quali l’aminoetossi-
3- vinilglicina, Ag(S O ) e AgNO3 , mentre
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hanno un effetto femminilizzante i precur-
sori o gli attivatori della biosintesi di questo
ormone vegetale come l’etephon (Mohan
Ram and Sett, 1982a; Mohan Ram and Sett,
1982b). La possibilità di reversione è sicuramente
un carattere a base genetica poiché
esistono dei genotipi suscettibili e dei
genotipi refrattari al trattamento di reversione.
In pieno campo il ciclo vitale della canapa
ha una durata di 5-6 mesi ed il
raggiungimento della maturità sessuale si
verifica dopo 3-4 mesi con la comparsa dei
fiori unisessuali. Il dimorfismo sessuale si
manifesta solo in uno stadio molto avanzato
dello sviluppo quando, poco prima della produzione
dei fiori, negli individui di sesso
maschile si verifica un particolare allungamento
degli ultimi internodi, fenomeno che
rende i maschi più alti ed esili delle femmine.
La possibilità di distinzione precoce del
sesso costituisce un problema basilare in ogni
programma di miglioramento genetico della
canapa, essendo questa una specie tipicamente
allogama. Per esempio, il metodo
Bredeman di selezione per la qualità della
fibra prevede un’analisi precoce qualitativa
e quantitativa della fibra negli individui di
sesso maschile, cui segue l’eliminazione e
quindi l’esclusione dalla possibilità di
impollinazione di quelli che non soddisfano
i parametri stabiliti (Bredeman, 1938).
L’obiettivo principale di questo lavoro è
stato quindi la ricerca di un sistema che permettesse
una discriminazione precoce ed affidabile
dei due sessi e che potesse costituire
un supporto utile ai programmi di miglioramento
genetico di Cannabis sativa.
L’altro aspetto investigato ha riguardato
più direttamente il meccanismo di determinazione
del sesso. Sebbene sia conosciuta
la relazione tra cromosomi eteromorfici e
sesso in Cannabis, nulla è ancora noto sui
meccanismi molecolari che sottendono a
questo processo.
Il lavoro di ricerca si è quindi sviluppato
da un lato verso l’analisi dei genomi di individui
di sesso maschile e femminile, mediante
la tecnica RAPD (Williams et al., 1990),
al fine di identificare sequenze di DNA sesso-specifiche;
e dall’altro verso la comprensione
dei meccanismi molecolari del
differenziamento sessuale in Cannabis. A
tale scopo è stata condotta un’analisi dell’espressione
genica differenziale, utilizzando
la tecnica cDNA AFLP.
MATERIALI E METODI
Analisi dei genomi mediante la tecnica
RAPD (Random Amplyfied Polymorphic
DNA). Semi appartenenti a 13 varietà ed
accessioni di Cannabis sativa, di diversa
origine (Faeti et al., 1996), sono stati fatti
germinare in serra e le plantule sviluppatesi
sono state trasferite in pieno campo fino al
raggiungimento della maturità sessuale, al
fine di identificare con certezza il sesso di
Agroindustria / Aprile 2002 9