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di canapa in Italia dovrebbe basarsi proprio su questo processo, che, oltre ad essere più adeguato al nostro clima, produce un filato di qualità superiore. Esso risulta, inoltre, maggiormente controllabile e produce una fibra più uniforme. I batteri svolgono un ruolo chiave nella biodegradazione del materiale pectico e le proprietà dei microrganismi degradatori influenzano sia l’andamento del processo che la qualità del prodotto finale. L’utilizzo di ceppi opportunamente selezionati, come inoculi nelle vasche, potrebbe rappresentare una valida strategia per migliorare la tecnica tradizionale di macerazione in acqua, rendendola indipendente dai batteri residenti. Con lo scopo di ottimizzare il processo di macerazione della canapa in acqua, nel presente lavoro, sono stati selezionati ceppi batterici aerobi e anaerobi dotati di attività pectinolitica elevata. Sono state poi effettuate prove di laboratorio di macerazione, impiegando spore dei ceppi selezionati. I risultati di tali esperimenti hanno permesso di individuare combinazioni di microrganismi e condizioni di macerazione che consentono di diminuire i tempi del processo e, allo stesso tempo, di aumentare la qualità della fibra prodotta. In questo lavoro è stata inoltre svolta la prima caratterizzazione molecolare, con tecniche basate sull’analisi del gene codificante il 16S rRNA (16S rDNA), dei microrganismi pectinolitici anaerobi che operano la biodegradazione delle sostanze cementanti durante la macerazione in acqua. MATERIALI E METODI Isolamento dei ceppi batterici. L’isolamento di ceppi batterici pectinolitici, aerobi ed anaerobi, è stato effettuato a partire da campioni di diversa provenienza (acqua di maceri, canapa, lino e suolo). La selezione delle spore dei ceppi sporigeni è stata effettuata mediante bollitura dei campioni per 5 minuti a 80°C. I ceppi aerobi sono stati isolati su terreno massimo (0.5% estratto di lievito, 0.5% pectone, 1% triptone) a 30°C. I ceppi anaerobi sono stati isolati su terreno massimo con la stessa composizione e aggiunta di 0.05% di cisteina e 2% di glucosio in atmosfera di CO 2 (Oxoid AnaeroGen kit AN25) a 37°C. I ceppi batterici pectinolitici sono stati individuati facendo crescere su terreno massimo solido contenente 0.5% di pectina, al termine della crescita le piastre sono state inondate con una soluzione 1% di cetiltrimetil ammonio bromuro (Donaghy et al., 1990). La comparsa di un alone chiaro intorno alla colonia indica la presenza di un’attività pectinolitica. Il ceppo tipo (T) di collezione Clostridium felsineum DSM 794 T (T = type strain) è stato impiegato come controllo. Determinazione dell’attività di degradazione dell’acido poligalatturonico. Tut- 50 Agroindustria / Aprile 2002 Tabella 1 - Attività pectinolitica su piastra dei ceppi anaerobi isolati. Table 1 - Bacterial strains with pectinolytic activity on solid medium. Campione N° Ceppi isolati Ceppi con attività Letame 41 6 Frammenti di canapa e lino macerati 128 44 Liquido di macerazione di lino 22 22 Liquido di macerazione di canapa 85 48 TOTALE 276 120 ti i ceppi pectinolitici isolati, aerobi e anaerobi, sono stati caratterizzati per l’attività di degradazione dell’acido poligalatturonico. L’attività enzimatica è stata misurata, con il metodo DNS (Miller, 1959), sul sopranatante delle colture fatte crescere in terreno massimo contenente 0.5% di pectina. Nel caso di ceppi anaerobi il saggio è stato eseguito dopo 3 giorni di crescita in anaerobiosi a 37°C, mentre, nel caso dei ceppi aerobi, dopo 2 giorni di crescita a 30°C in agitazione (250 rpm). Il ceppo tipo di collezione Clostridium felsineum DSM 794 T è stato impiegato come controllo. Materiale vegetale. La canapa (Cannabis sativa L. cv Fibranova), cresciuta ad Anzola (Bologna), è stata raccolta una settimana circa dopo il punto medio di fioritura. La canapa verde è stata fatta seccare nel campo fino a che il contenuto di acqua ha raggiunto circa il 10% e quindi è stata ridotta in balle, queste sono state conservate al coperto e dopo un periodo di due mesi sono state aperte ed impiegate per gli esperimenti. Prove di laboratorio di macerazione. Per le prove di laboratorio sono state allestite vasche di plastica colme d’acqua. Una delle vasche non è stata inoculata con alcun ceppo (controllo). Sono state allestite vasche in cui sono state mantenute condizioni d’aerobiosi per tutto il processo, facendo gorgogliare acqua mediante una pompa (vasche areate), e vasche non areate. Ogni vasca è stata inoculata con spore di differenti ceppi (aerobi, anaerobi o in combinazione mista, aerobi e anaerobi) precedentemente selezionati per l’elevata attività pectinolitica. In ogni vasca sono stati introdotti quattro mazzi, ognuno di quattro steli, e sono stati prelevati dopo tempi di macerazione diversi (3, 6, 9 e 12 giorni). I fasci di fibre sono stati analizzati valutandone le proprietà morfologiche e fisiche. Analisi delle fibre. Dei campioni di fasci di fibre ottenuti dalle prove di macerazione in vasca sono stati valutati il colore, il grado di separazione e la sofficità. È stata determinata la finezza delle fibre valutata come rapporto peso/lunghezza. Analisi del 16S rDNA. Per l’analisi del 16S rDNA il DNA totale è stato estratto con il kit FastDNA (BIO 101) e il FastPrep Instrument da cellule cresciute su terreno solido. Il gene 16S rDNA è stato amplificato impiegando una coppia di primer universali (P0, GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG [posizione 7-27] e P6, CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA [posizione 1514-1495]. La numerazione è riferita alla sequenza del 16S rDNA di Escherichia coli). L’avvenuta amplificazione di un prodotto delle dimensioni attese (di 1507 pb) è stata verificata mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio. Per l’analisi ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis), il prodotto d’amplificazione così ottenuto è stato trattato, in reazioni enzimatiche singole, con i tre enzimi di restrizione Alu I, Rsa I e Hinf I. I profili ARDRA così ottenuti sono stati visualizzati mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio al 2.5%. RISULTATI Isolamento di ceppi pectinolitici anaerobi. Da campioni di diversa provenienza sono stati selezionati 276 ceppi sporigeni anaerobi (Tab. 1). Mediante saggio enzimatico su piastra sono stati individuati 120 ceppi pectinolitici. È stata quindi misurata l’attività di degradazione dell’acido poligalatturonico di tutti i ceppi pectinolitici. L’attività è stata misurata sui sopranatanti di colture Tabella 2 - Attività di degradazione dell’acido poligalatturonico. I risultati sono espressi in U.I., definite come mmoli di gruppi riducenti (il prodotto finale della reazione) rilasciati in un minuto a 45°C per 1 ml di sopranatante. Le U.I. sono corrette per il peso umido delle colture. Table 2 - Polygalacturonic acid degrading activity. Results are expressed in I.U., defined as mmol of reducing groups (the reaction end product) produced after one minute at 45°C by 1 ml supernatant. I.U. are divided by the culture wet weight. N° di ceppi Attività enzimatica U.I. mg -1 cellule C. felsineum DSM 794 T 0.03 7 0.1 - 0.2 19 0.031 - 0.09 25 0.02 - 0.03 23 0.01 - 0.019 46 < 0.01
Tabella 3 - Risultati di prove di laboratorio di macerazione. L’acqua delle vasche è stata inoculata con spore di ceppi di Clostridium selezionati. Table 3 - Retting in laboratory tanks, supplemented with different Clostridium strains. Tipo di macerazione L1-6 Temperatura dell’acqua (°C) Tempo di macerazione (giorni) liquide cresciute a 37°C e in condizioni d’anaerobiosi, per tre giorni in terreno massimo contenente 0.5% di pectina. Indagini condotte su miscele enzimatiche di varie composizioni sembrano dimostrare come la capacità macerativa sia correlata con l’attività di degradazione della componente non metilata della pectina (Zhang et al., 2000). L’attività di degradazione dell’acido poligalatturonico potrebbe dunque fornire indicazioni sulle potenzialità macerative dei ceppi isolati. Questa analisi ha consentito di identificare 26 ceppi dotati di attività pectinolitica superiore al controllo, il ceppo tipo di collezione della specie C. felsineum DSM 794 T (Tab. 2), (Mastromei et al., 2001). Prove di laboratorio di macerazione con inoculi di ceppi anaerobi. Sono state allestite prove preliminari di laboratorio di macerazione in acqua; all’inizio del processo, l’acqua di ognuna delle vasca è stata inoculata con uno dei ceppi anaerobi selezionati, dotati di attività pectinolitica superiore al controllo C. felsineum DSM 794 T . Al termine della macerazione le fibre sono state separate dagli steli manualmente e sottoposte a determinazione delle proprietà morfologiche, e fisiche. Tra gli 11 ceppi batterici saggiati, due ceppi, L1-6 e C1-6, hanno fornito i migliori risultati. Nonostante la temperatura piuttosto bassa dell’acqua delle vasche (20°C), il grado ottimale di macerazione è stato ottenuto in soli 6 giorni, contro i 12 del controllo (Tab. 3). Nel caso degli altri ceppi analizzati il grado ottimale di macerazione veniva raggiunto in tempi superiori rispetto ai ceppi L1-6 e C1-6, ma sempre inferiori rispetto al controllo. Oltre a accelerare il processo, dimezzandone la durata, i due ceppi con capacità macerativa maggiore hanno prodotto una fibra di qualità superiore rispetto al Sofficità delle fibre (S) a Finezza delle fibre (g m -1 ) Colore delle fibre 20.2 6 5.0 0.030 Bianco argentato C1-6 20.1 6 5.0 0.037 Bianco argentato Controllo a Analisi visiva (1-5). 20.2 12 4.0 0.062 Grigio controllo, più soffice, più sottile e di colore chiaro (Tab. 3), (Di Candilo et al., 2000). Isolamento di ceppi pectinolitici aerobi. L’inoculo delle vasche con ceppi anaerobi selezionati consente di diminuire i tempi di macerazione e aumentare la qualità del prodotto. Tuttavia la germinazione delle spore dei ceppi anaerobi richiede l’istaurarsi di condizioni di anaerobiosi nel macero, che si realizzano solo dopo una fase di accrescimento di batteri aerobi. La selezione di ceppi aerobi, dotati di attività pectinolitica elevata, potrebbe permettere un ulteriore miglioramento e accelerazione del processo. L’impiego combinato di ceppi (aerobi e/o anaerobi), opportunamente selezionati, potrebbe permettere di ottenere un miglior controllo sul processo e una qualità della fibra più uniforme. Da campioni d’acqua di macerazione di canapa provenienti da maceri con diversa localizzazione geografica (Tab. 4) sono stati isolati un totale di 123 ceppi. Tra gli isolati sono stati individuati 25 ceppi pectinolitici, mediante saggio enzimatico su piastra. Per tutti i ceppi pectinolitici aerobi è stata misurata l’attività di degradazione dell’acido poligalatturonico sui sopranatanti di colture liquide cresciute per due giorni a 30°C in terreno massimo contenente 0.5% di pectina. Tra tutti i ceppi isolati il ceppo ROO-2A si è dimostrato quello dotato di attività pectinolitica maggiore. La determinazione della sequenza parziale del 16S rDNA ha permesso di attribuire il ceppo ROO-2A al genere Bacillus. Prove di laboratorio di macerazione di canapa con inoculi di ceppi aerobi ed anaerobi. Sono state allestite prove di laboratorio di macerazione in vasca in modo da confrontare quattro diverse condizioni di macerazione; all’inizio della macerazione Tabella 4 - Ceppi aerobi isolati da acqua di maceri di diversa provenienza. Table 4 - Aerobic strains isolated from retting tank water from different areas. Provenienza N° Ceppi isolati Ceppi con attività pectinolitica Nadlac, Romania 67 18 Nagylak, Ungheria 56 7 TOTALE 123 25 sono state inoculate nell’acqua delle vasche spore di un ceppo anaerobio (L1-6 o C1-6) oppure di un ceppo aerobio (ROO-2A) e di un ceppo anaerobio (L1-6). Nella terza vasca sono state mantenute condizioni di areazione per tutto il processo e l’acqua della vasca è stata inoculata con spore del ceppo aerobio ROO-2A. Il controllo dell’esperimento è consistito in una vasca senza alcun inoculo in cui si è operata una macerazione tradizionale. Non è stato rivelata alcuna accelerazione della macerazione, rispetto alla vasca di controllo, quando il processo è stato effettuato in condizioni di areazione continua e inoculo di un ceppo aerobio. La fibra ottenuta è inoltre risultata scadente presentando, al termine del processo, una vistosa colorazione bruna. I migliori risultati sono stati ottenuti con l’inoculo combinato di un aerobio e di uno anaerobio; in queste condizioni il grado ottimale di macerazione è stato raggiunto dopo solo quattro giorni, contro i 12 del controllo o i 6 della vasca inoculata con il solo ceppo anaerobio. Caratterizzazione molecolare dei ceppi anaerobi pectinolitici. I 122 ceppi anaerobi pectinolitici isolati sono stati caratterizzati mediante ARDRA. L’ARDRA è una metodica rapida e riproducibile che consente la tipizzazione di ceppi batterici, ovvero permette di suddividere degli isolati batterici in più gruppi omogenei, che spesso corrispondono a specie batteriche (Vaneechoutte et al., 1992). L’analisi ARDRA con gli enzimi di restrizione Alu I, Rsa I e Hinf I ha consentito di suddividere i 120 isolati in 5 gruppi, ciascuno contenente isolati con lo stesso profilo con i tre enzimi (Fig. 1). Il gruppo ARDRA C è risultato essere il più popolato raccogliendo l’86% degli isolati. I 26 ceppi dotati di attività pectinolitica superiore al controllo (> 0.03 U.I. mg -1 di cellule) sono stati raggruppati in 3 gruppi ARDRA (Fig. 2). Figura 1 - Distribuzione dei ceppi pectinolitici nei gruppi ARDRA. Figure 1 - Distribution of the pectinolytic strains in the 5 ARDRA groups. Agroindustria / Aprile 2002 51
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