Linea di Ricerca 1 - Fondazione Don Carlo Gnocchi

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– O’Brien J, Bedoni M, Blake A, Scully J, Forvi E, Casella M, Gramatica F, O’Mahoney C. Hollow microneedles for pain-free drug delivery. MicroMechanics Europe. Toulouse (France), 20-22 settembre 2009. Papers: – Matteucci M, Fanetti M, Casella M, Gramatica F, Gavioli L, Tormen M, Grenci G, De Angelis F, Di Fabrizio E. Poly vinyl alcohol re-usable masters for microneedle replication”. Microelectronic Engineering. 2009;86:752-756 Brevetto: – MI2010A002414 depositato in data 27/12/2010 da Fondazione Don Carlo Gnocchi ONLUS. Inventori: Gramatica Furio, Forvi Elena, Bedoni Marzia, Cassarà Domenico Giorgio, Casella Michele. Titolo: “Apparecchiatura ad aghi per la somministrazione transdermica di farmaci”. Linea di Ricerca 1 Sviluppo di un sensore ottico innovativo per l’analisi in tempo reale di sostanze nel sangue per la diagnosi e la somministrazione controllata di farmaci Responsabile: Gramatica Furio INTRODUZIONE Un aspetto che riveste una fondamentale importanza nella ricerca clinica, per esempio nell’ambito del cancro, di malattie croniche e acute, è rappresentato dallo sviluppo e dalla messa a punto di test semplici e non invasivi in grado di effettuare una diagnosi precoce, di formulare una prognosi accurata e di fornire indicazioni sulla scelta terapeutica più adeguata. I recenti progressi ottenuti nel campo della ricerca clinica hanno reso possibile l’identificazione di geni espressi in diverse situazioni clinico-patologiche e biologiche (nel tessuto patologico rispetto al tessuto normale, in tumori aggressivi rispetto a tumori indolenti simili per stadio clinico-patologico ecc.), proposti come una nuova classe di marcatori specifici, prognostici e/o predittivi. La possibilità di individuare questi nuovi biomarcatori con tecniche ancora più sensibili e specifiche di quelle attualmente in uso (PCR, ELISA, istologia) presso i laboratori clinici porterà a un miglioramento dei test di follow-up (aumentandone la specificità e diminuendo il costo dei trattamenti) e della definizione della scelta terapeutica (rendendo possibile una terapia personalizzata e razionalizzando quindi i costi dei trattamenti con una riduzione della loro non-appropriatezza). Esistono alcuni metodi spettroscopici – noti in ambito fisicochimico e solo parzialmente approdati al versante di ricerca biomedicale – che presentano sensibilità, specificità e rapidità d’uso anche milioni di volte superiori rispetto alle metodiche convenzionali. Tra questi sta assumendo particolare rilievo, a livello internazionale, la spettroscopia ottica vibrazionale (Raman classica, Raman risonante e Surface Enhanced Raman Spectroscopy-SERS) basata su un effetto fisico noto dagli anni ’20 e utilizzato in scienze dei materiali dagli anni ’70, con l’avvento dei laser. Negli ultimi cinque anni si sono moltiplicati gli studi e le pubblicazioni relative alla spettroscopia Raman applicata alla detezione di biomarcatori (Nguyen CT, 2010; Joshi B, 2010 ) o di modificazioni biochimiche di tessuti correlate Ricerca corrente 49
Ricerca corrente 50 Linea di Ricerca 1 a processi patologici (Beljebbar A, 2009) e la prospettiva di una reale applicazione in ambito clinico è vicina. OBIETTIVI Il razionale del seguente progetto è quindi legato all’opportunità di utilizzo della biofotonica, e in particolare di sistemi Raman commerciali, nell’ambito di una costituenda piattaforma tecnologica di biofotonica clinica, per lo sviluppo di un sensore ottico minimamente invasivo e indolore, di semplice uso ed elevatissima sensibilità e specifi cità. I principali obiettivi del progetto sono: progettazione e sviluppo dei sensori diagnostici: sonda di fi bra ottica funzionalizzata con nanoparticelle, utilizzante spettroscopia SERS, per effettuare misure quali-quantitative immediate e a elevatissima sensibilità di analiti e biomarcatori (oncogeni) in fl uidi corporei; validare la metodica Raman classica nell’ambito di nuove applicazioni diagnostiche attraverso un’analisi comparativa con le tecniche tradizionali in termini di sensibilità e specifi cità. METODI La prima fase del progetto ha comportato la progettazione di: nanoparticelle d’oro magnetiche, oligonucleotidi creati ad hoc per legarsi alla nanoparticella e riconoscere basi di un gene target e oligonucleotidi legati a Raman probes come sensori SERS attivi. In quest’ultimo anno stiamo effettuando dei test preliminari in vitro come “proof of concept” per l’identifi cazione del gene beta actina che, essendo di facile detezione, ci permette di concentrare la nostra attenzione solo sull’ottimizzazione delle nanoparticelle funzionalizzate e i Raman probes, al fi ne di rendere il sensore altamente selettivo e sensibile. La seconda fase del progetto, che ci vedrà impegnati nel prossimo anno, riguarderà la creazione e la sperimentazione di sensori completi per la rilevazione di biomarcatori target in fl uidi biologici umani mediante spettroscopia Raman. Gli esperimenti sono effettuati in parallelo con uno spettroscopio Raman da banco dotato di microscopio confocale e con un video-Raman portatile. Infi ne la validazione del sistema SENSI-Raman avverrà tramite confronto in parallelo con la metodica standard PCR. I termini di confronto si baseranno su sensibilità, specifi cità e rapidità. RISULTATI I risultati ottenuti dal processo iniziale di progettazione ci hanno permesso di identifi care le specifi che tecniche ad hoc di: nanoparticelle metalliche magnetiche, oligonucleotidi, Raman probes. Dopo alcuni test esplorativi iniziali, sono state progettate e create presso il Dipartimento di Biotecnologie e Bioscienze dell’Università di Milano-Bicocca, delle nanoparticelle magnetiche ottimali di 300 e 500 nm. Fig. 1 2 μm Microfotografi a di un cluster di nanoparticelle da 500 nm coniugate con Rhodamine 6G. Le nanoparticelle si presentano come cluster di dimensioni di diverse decine di micrometri. Sono stati effettuati spettri SERS delle nanoparticelle coniugate con Rhodamine 6G utilizzando laser di lunghezza d’onda pari a 532 nm e potenza di 0,075 mW. I modi Raman-vibrazionali delle molecole, ottenuti sperimentalmente e riportati in Fig. 2, sono risultati confrontabili con i modi pubblicati in letteratura. Dai risultati ottenuti abbiamo determinato che la Rhodamine 6G possa essere il Raman probe candidato per la realizzazione del primo sensore sperimentale. PRODOTTI SCIENTIFICI Abstract presentati a Congressi Internazionali e Nazionali: – Casella M, Lucotti A, Tommasini M, Bedoni M, Forvi E, Gramatica F, Zerbi G. Rapid Investigation on Fresh Human
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