Luciana Basili Dias Candidíase vulvovaginal em pacientes gestantes

Metodologia 44
Este meio é sintético e recomendado através de resultados obtidos por estudos
comparativos dentre vários meios sintéticos (Fromtling et al., 1993).
O controle de esterilidade do meio RPMI-1640 foi feito na primeira coluna em todas
as placas. Os orifícios da coluna 1 receberam apenas 200 µL de RPMI-1640 que serviram para
comprovar a ausência de contaminação do meio. O controle de crescimento da reação foi feito
em todas as placas na coluna 12 com 100 µL de RPMI-1640 e 100 µL do inóculo da levedura,
considerando adequado quando a absorbância foi maior que 0,4 (Galgiani & Stevens, 1976).
Para preparação do inóculo as amostras de leveduras do gênero Candida foram
cultivadas em tubos contendo meio Sabouraud sólido sem cloranfenicol e incubadas a 35º C
durante 24 horas. A massa de células obtida foi recolhida assepticamente com alça esterilizada e
ressuspensa em tubos contendo 5 mL de solução salina 0,85% estéril, com turbidez após a
homogeneização em vórtex, equivalente a escala 0,5 de McFarland, com concentração
equivalente a 1 x 10 6 a 5 x 10 6 células por mL (CLSI, 2005). A leitura da turbidez foi feita em
espectofotometria a 530 nm. Após preparo do inóculo foi feita uma diluição 1:50 e depois 1:20
com meio de cultura RPMI-1640, para obter um inóculo com concentração de 1 x 10 3 a 5 x 10 3
UFC/mL.
O inóculo, referente a cada amostra de levedura, foi distribuído nas placas contendo
antifúngico (CTZ, FCZ, ITZ, AMB), em alíquotas de 100 µL e incubados à temperatura de 35º C
por um período de 48 horas. As placas de AMB foram protegidas da luz durante todo o processo.
Em todos os testes foram utilizadas as cepas padrão de referência Candida parapsilosis ATCC
22019 e Candida krusei ATCC 6258 para controle de qualidade da reação.
A leitura das placas foi realizada através de leitura visual após 48 horas de incubação
a 35º C, observando presença ou ausência de crescimento visível, depois de agitar as placas no
agitador de Kline. Os poços de microdiluição receberam uma pontuação (escore). O crescimento
em cada poço foi comparado com o poço controle de crescimento com auxílio de um espelho de
leitura; assim cada poço recebeu um valor numérico, usando a seguinte escala: 0 – opticamente
claro; 1 – crescimento indefinido; 2 – redução proeminente de crescimento; 3 – ligeira redução
do crescimento; e 4 – nenhuma redução do crescimento. O valor de CIM da anfotericina B foi
definido como a menor concentração que se observa o escore 0, sendo a CIM para os azólicos a
menor concentração em que foi observado o escore 2, o que corresponde à aproximadamente
50% da inibição do crescimento (CLSI, 2005). Toda leitura visual foi confirmada pela leitura da
absorbância de luz, em leitor de ELISA com comprimento de onda de 492 nm, através do
espectofotômetro Multiskan Titertek (Flow Laboratories, Sweden) 48 horas após preparação das
placas (Figura 16).