Forschungsprojekte Anthropogene Spurenstoffe - DWA

Forschungsprojekte zu anthropogenen Spurenstoffen im Wasserkreislauf
27 Titel
Kurztitel
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Projektnehmer
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Projektträger/
Finanzierung
Entwicklung und Validierung eines Caenorhabditis elegans Biomonitor-
Tests auf DNAEbene (Transkriptionsebene) zur Prüfung von
Arzneimitteln, Bioziden und anderen Umweltchemikalien
Institut für Biologie
AG Ökotoxikologie & Biochemie der Freien Universität Berlin
Dr. Ralph Menzel und Kerstin Reichert, Institut für Biologie, AG
Ökotoxikologie & Biochemie der Freien Universität Berlin
UBA
Laufzeit Bis 2/2004
Kurzfassung
Ziel des vorgestellten Projektes war die Entwicklung eines Biomonitor-Tests auf
Transkriptionsebene mit dem Nematoden Caenorhabditis elegans zur Prüfung von
Arzneimittel, Bioziden und anderen Umweltchemikalien im subletalen
Konzentrationsbereich. Dabei sollte geprüft werden, ob Veränderungen im
Genexpressionsmuster durch die eingesetzten Testsubstanzen hervorgerufen werden und
inwiefern signifikante Effektschwellen früher als in einem klassischen Biotest überschritten
werden. Für die Erfassung der schadstoffbedingten Veränderungen in den
Genexpressionsmustern wurden drei molekularbiologische Testsysteme entwickelt: eine
semiquantitative Single worm RT-PCR, ein transgener GFP-Reporter Nematodenstamm und
ein low densitiy DNA Array, der „Celegans Toxchip“. Die Entwicklung und
Validitätsprüfung des Celegans Toxchip stand dabei im Mittelpunkt der Arbeiten. Die
molekularbiologischen Untersuchungen wurden für eine stärkere Aussagekraft von
Reproduktionstests im Flüssigmedium und im Boden begleitet. Die Reprotests wurden
optimiert und für bis zu neun verschiedene Testsubstanzen standardisiert durchgeführt. Dabei
zeigte sich für alle Testsubstanzen eine Konzentrations-Effekt-Beziehung. Dadurch wird die
Eignung des Nematoden C. elegans als ökotoxikologischer Testorganismus bestätigt.
Basierend auf gesamtgenomischen Analysen gelang erstmalig die Identifikation von 64
potenziell schadstoffinduzierbaren C. elegans Genen, die Amplifikation bzw. Klonierung
von entsprechenden cDNA Fragmenten und deren Reinigung. Mit Hilfe dieser Fragmente
und einer Reihe von Kontrollproben wurde anschließend der Celegans Toxchip als ein low
density DNA Array durch Bespotten von poly-L-Lysin beschichteten Glas-Slides hergestellt
und unter Einbeziehung von sieben Testsubstanzen intensiv getestet. Parallel dazu wurde die
Expression von vier Cytochrom P450 Genen mittels RT-PCR quantifiziert und die
Fluoreszenzemission eines transgenen Nematodenstammes gemessen, welcher unter
Kontrolle eines Cytochrom P450 Promotors das grün fluoreszierende Protein (GFP)
exprimierte. Dabei folgten die Hauptexperimente immer einem einheitlichen Schema: Die
Nematoden wurden in An- und Abwesenheit der jeweiligen Testsubstanz inkubiert,
anschließend geerntet, (die Fluoreszenz vermessen) ihre RNA isoliert und diese in cDNA
umgeschrieben. Die jeweilige Quantifizierung der induzierten Genexpression zeigte, dass
signifikante Effekte bereits bei deutlich geringeren Konzentrationen auftraten als in den
herkömmlichen Reproduktionstests. Insbesondere der GFP Test und die RT-PCR
Untersuchungen zeigten eine signifikante und reproduzierbare Konzentrations-Effekt
Abhängigkeit. Die verwendeten Untersuchungssysteme erwiesen sich als hochempfindliche
und schnell einsetzbare Biomonitor-Test und bestätigten die hohe Nützlichkeit des Faktors
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