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Serum-free Systems
Production and serumfree cultivation of dendritic cells
from mononuclear cells of peripheral blood (PBMC).
Instructions:
Separation of Blood with Separating Medium
(Pancoll 1,077 g/ml)
The blood samples should be processed as soon as possible
after production in order to achieve optimal results. A storage
of the blood samples for 24 hours at ambient temperature
causes among other things a reduced output of
lymphocytes, a change of the surface markers and a reduced
response on mitogen stimulation.
1) Add Pancoll (3 ml) into a suitable, sterile centrifuge
tube under sterile conditions.
2) Carefully coat the separating medium with the diluted
blood sample (4 ml). Important: Don‘t mix the blood
sample with Pancoll!
3) Centrifugation at 400 x g for 30 - 40 minutes at
18 - 20° C.
4) After the centrifugation, carefully take off the upper
phase (containing serum and platelets) with a pipette
without mixing the interphase with the lymphocytes.
5) Transfer the lymphocyte band into a new centrifuge
tube with a new pipette. Here it is important to take
off the whole material of the interphase with as little
volume as possible.
6) Add at least 3 volumes of a physiological saline solution
(6 ml) to the lymphocytes.
7) Carefully suspend the lymphocytes with a pipette.
8) Centrifugation at 60 - 100 x g for 10 minutes at
18 - 20° C.
9) Reject the supernatant. Repeat washing step (point
6 - 9).
Serumfree Cultivation of Dentritic Cells
in Panserin 416:
After the last washing step the mononuclear cells are
transferred with a cell density of 1 x 10 7 cells/ml into Panserin
416. In order to remove non-adherent cells, the culture
dishes are put into the incubator for 2 hours. Then
the supernatant is carefully taken off and replaced by new
Panserin 416. GM-CSF (800 U/ml) and interleukin-4 (500
U/ml) are added as growth factors. The culture dishes are
incubated for another 6 days in the incubator and every
day half of the medium is replaced by new medium which
is supplemented by GMCSF and IL-4.
BIOTECH GmbH
1.40
Serum-freie Systeme
PANSERIN 416/PANSERIN 416
Gewinnung und serumfreie Kultivierung dendritischer Zellen
aus mononucleären Zellen aus periphärem Blut (PBMC).
Gebrauchsanweisung:
Auftrennung von Blut mit Trennmedium
(Pancoll 1,077 g/ml)
Die Blutproben sollten sobald wie möglich nach der Gewinnung
verarbeitet werden um optimale Ergebnisse zu
erzielen. Eine Lagerung der Blutproben für 24 Stunden
bei Raumtemperatur bewirkt unter anderem eine verminderte
Ausbeute an Lymphozyten, eine Veränderung der
Oberflächenmarker und eine verminderte Antwort auf
Mitogen-Stimulation.
1) Unter sterilen Bedingungen Pancoll (3 ml) in ein geeignetes,
steriles Zentrifugenröhrchen vorlegen.
2) Vorsichtig mit der verdünnten Blutprobe (4ml) die
Trennlösung überschichten. Wichtig: Blutprobe und
Pancoll nicht vermischen!
3) Zentrifugation bei 400 x g für 30 - 40 Minuten bei
18 - 20° C.
4) Nach der Zentrifugation obere Phase (enthält Serum
und Platelets) vorsichtig mit einer Pipette abnehmen,
ohne die Interphase mit den Lymphocyten zu vermischen.
5) Mit einer neuen Pipette die Lymphozyten-Bande in ein
neues Zentrifugenröhrchen überführen. Wichtig dabei
ist, das gesamte Material der Interphase mit möglichst
wenig Volumen zu entnehmen.
6) Mindestens 3 Volumina einer physiologischen Salzlösung
(6 ml) zu den Lymphozyten geben.
7) Mit einer Pipette die Lymphozyten vorsichtig suspendieren.
8) Zentrifugation bei 60 - 100 x g für 10 Minuten bei
18 - 20° C.
9) Überstand verwerfen. Waschschritt wiederholen (Punkt
6 - 9).
Serumfreie Kultivierung von dendritischen Zellen
in Panserin 416:
Die mononucleären Zellen werden nach dem letzten Waschschritt
mit einer Zelldichte von ca. 1 x 10 7 Zellen/ml in
Panserin 416 überführt. Um nicht adhärente Zellen zu entfernen,
werden die Kulturgefäße für 2 Stunden in den Brutschrank
gestellt. Der Überstand wird dann vorsichtig abgezogen
und mit neuem Panserin 416 ersetzt. Als Wachstumsfaktoren
werden GM-CSF (10ng/ml) und Interleukin-4
(10 ng/ml) zugesetzt. Die Kulturgefäße werden für weitere
6 Tage im Brutschrank bebrütet, wobei jeden Tag die Hälfte
des Mediums mit neuem Medium, supplementiert mit
GMCSF und IL-4, ersetzt wird.
PANSERIN 416 with one supplement / mit einem Supplement 500 ml P04-710416
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