XLI Congreso Anual de la Asociación Española para el Estudio del Hígado

XLI Congreso Anual de la Asociación Española para el Estudio del Hígado 69
zaron 3 plataformas analíticas distintas de UPLC-MS para el análisis
de ácidos biliares, ácidos grasos, esteroides, lisoglicerofosfolípidos,
aminoácidos, glicerofosfolípidos, lípidos de esterol y esfingolípidos.
Resultados: Se identificaron más de 530 metabolitos. Considerando
cada tipo de metabolito de forma individual 93 cambiaron
durante la administración de bezafibrato. Aumentó la cantidad de
PE (0:0/16:1), ChoE (16:1), mientras que disminuyeron las PC
(17:0/18:2), PC (17:0/0:0), PC (15:0/22:6), PC (18:3/18:3) y PC
(18:0/20:4). En los pacientes que presentaron mejoría o desaparición
del prurito se identificó un descenso (p < 0,01) en 38 metabolitos,
sobretodo diminuyeron los niveles de PC (18:3/18:3), PC
(18:0/20:4), PC (38:5), PC (16:0/22:6), PC (14:0/20:4), TG (56:5) y
PC (15:0/22:6) (p < 0,001). En los pacientes que quedaron sin prurito
también se identificó descenso del ácido araquidónico omega
6, 20:4n-6 y de varios PC con la cadena de ácidos grasos esterificada
20:4 y ChoE (20:4). 22 de estos metabolitos aumentaron tras la
suspensión del bezafibrato, principalmente fosfatidil y lisofosfatidilcolinas
(p < 0,001), androsterona y sulfato de androsterona con
sus respectivos isómeros (p < 0,02).
Conclusiones: El tratamiento con bezafibrato se asocia a una
disminución de los metabolitos circulantes, especialmente descenso
de fosfolípidos y algunos esteroles. El análisis metabolómico
identifica un panel de biomarcadores que puede facilitar el reconocimiento
del efecto metabolómico del bezafibrato en la CBP, que
pueden intervenir en la patogenia del prurito colestásico.
del THC. Para investigar su repercusión funcional, se clonó la ORF
de ACOX2 y mediante mutagénesis dirigida se obtuvo la variante
mutada (ACOX2mut). Utilizando vectores lentivirales, las variantes
ACOX2 y ACOX2mut se expresaron establemente en células de hepatoblastoma
humano HepG2. Mediante western blot e inmunofluorescencia
se observó que la mutación no altera ni el tamaño
de la proteína ni su localización peroxisomal. La síntesis de ácidos
biliares en estas células se investigó utilizando como sustrato THC.
El análisis por HPLC-MS/MS de los productos de la ruta biosintética
mostró que en células que expresaban ACOX2mut la formación de
ácido cólico a partir de THC se reducía en un 94% respecto a las que
expresaban ACOX2, observándose también la acumulación del precursor.
En las células que expresaban ACOX2mut, la exposición (72
h) a diferentes concentraciones de THC causó un marcado estrés
oxidativo (medido por citometría de flujo utilizando CellROX ® ) y
una menor viabilidad celular (test de formazán) que en las que
expresaban ACOX2.
Conclusiones: Este es el primer caso descrito de deficiencia en
la actividad de la enzima peroxisomal ACOX2, en cuyo gen se ha
identificado una mutación que en homocigosis produce una alteración
funcional en la vía de síntesis de ácidos biliares con acumulación
de metabolitos hepatotóxicos, lo que justifica la hipertransaminasemia
persistente en el paciente afectado. La identificación
de las bases moleculares de este trastorno constituye un paso esencial
para la elección de su tratamiento.
P-84. IDENTIFICACIÓN DE UN DEFECTO GENÉTICO
EN LA ETAPA PEROXISOMAL DE SÍNTESIS DE ÁCIDOS
BILIARES QUE OCASIONA DAÑO HEPATOCELULAR POR
ACUMULACIÓN DE PRECURSORES TÓXICOS
M. Alonso a , M.J. Monte a,b , O. Briz a,b , E. Herráez a,b , R. Al-Abdulla a ,
J.M. Argemí b,c , J. Prieto b,c y J.J.G. Marín a,b
a
Hepatología Experimental y Vectorización de Fármacos
(HEVEFARM), Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca
(IBSAL), Universidad de Salamanca. b Centro de Investigación
Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas y Digestivas
(CIBERehd). c Departamento de Medicina, Clínica Universidad de
Navarra, Centro de Investigación Médica Aplicada (CIMA),
Universidad de Navarra, Pamplona.
Introducción: Los defectos genéticos en la síntesis de ácidos biliares
causan enfermedades raras caracterizadas por acumulación
de especies moleculares de ácidos biliares minoritarios y/o de metabolitos
intermediarios, algunos de ellos con capacidad hepatotóxica.
Objetivos: Investigar el caso de un varón adulto joven con hipertransaminasemia
persistente de causa no identificada, cuyos síntomas
y signos clínicos hacían sospechar una alteración en el metabolismo
de los ácidos biliares.
Métodos y resultados: El análisis por HPLC-MS/MS del suero y la
orina reveló la existencia de niveles extremadamente bajos de ácidos
biliares normales en comparación con 5 sujetos sanos (suero:
0,06 ± 0,01 mM vs 4,68 ± 0,61 mM; orina: 0,07 ± 0,02 mM vs 1,18 ±
0,13 mM), junto a evidencias de la presencia, en forma tauro-conjugada,
de un metabolito intermediario en la síntesis de ácido cólico,
el ácido trihidroxicolestanoico (THC), lo que se confirmó por
determinación de “masa exacta” mediante HPLC-TOF. Para estudiar
las bases genéticas del trastorno, a partir del ADN del paciente
se amplificaron (PCR de alta fidelidad) y se secuenciaron todos los
exones de las enzimas potencialmente responsables de la acumulación
de este metabolito. Sólo se encontró como cambio sospechoso
una mutación en homocigosis (c.673C > T, exón 6, gen ACOX2) que
ocasiona un cambio de aminoácido (p.Arg225Trp) en la enzima peroxisomal
ACOX2 implicada en el acortamiento de la cadena lateral
P-85. PERFIL DE EXPRESIÓN GÉNICA EN CÉLULAS
OSTEOBLÁSTICAS TRATADAS CON ÁCIDO LITOCÓLICO
O BILIRRUBINA. IMPLICACIONES EN LA PATOGENIA
DE LA OSTEOPOROSIS EN LAS ENFERMEDADES HEPÁTICAS
S. Ruiz-Gaspà a , N. Guañabens b , M. Dubreuil a , P. Peris a ,
A. Monegal a y A. Parés a
a
Unidades de Hepatología y de Patología Metabólica Ósea,
Hospital Clínic, Universidad de Barcelona, IDIBAPS, CIBERehd,
Barcelona. b Unidades de Hepatología y de Patología Metabólica
Ósea, Hospital Clínic, Universidad de Barcelona, IDIBAPS,
CIBERehd, Barcelona.
Introducción: La característica principal de la osteoporosis asociada
a la colestasis y a los estadios finales de la enfermedad hepática
es la baja formación ósea. Estudios previos han mostrado los
efectos perjudiciales de las sustancias retenidas en la colestasis
como el ácido litocólico (LCA) y la bilirrubina (BIL) sobre los osteoblastos
humanos y células osteoblásticas, incluyendo la expresión
diferencial de algunos genes implicados en la osteoclastogénesis y
la apoptosis de células osteoblásticas. Estos efectos se neutralizan
total o parcialmente por el ácido ursodesoxicólico (UDCA).
Objetivos: Evaluar la expresión diferencial de genes en células
osteoblásticas tras su exposición a sustancias retenidas en la colestasis
y a ácido ursodesoxicólico.
Métodos: Los experimentos se han realizado en células de osteosarcoma
humano (Saos-2), cultivadas con LCA (10 mM), BIL (50 mM)
o UDCA (10 y 100 mM) durante 2 y 24 horas. La expresión de genes
de diferentes rutas de señalización relacionadas con el metabolismo
óseo fue analizada mediante tecnología TaqMan usando micro
fluidic cards. Los 88 genes analizados cubrían una amplia gama de
actividades funcionales que incluyen la apoptosis, la diferenciación
de los osteoblastos y osteoclastos, y la mineralización, así como la
expresión de genes implicados en la síntesis y degradación de colágeno,
factores de crecimiento y vascularización.
Resultados: El LCA aumenta la expresión de diversos genes relacionados
con la apoptosis (BAX, BCL10, BCL2L13, BCL2L14), pero
también de MGP (matrix Gla protein), BGLAP (osteocalcina), SPP1
(osteopontina) y CYP24A1, y disminuye la expresión de las bone
morphogenetic proteins (BMP3 y BMP4) y DKK1 (Dickkopf-related