dr. Zádori Anita - Semmelweis Egyetem Doktori Iskola

párhuzamos mérésből nyert adatokból átlagot és szórást számoltunk. A különböző
kezelt tenyészetek közötti eltérések szignifikanciáját egy- és több szempontos variancia-
analízissel és Student-féle T-teszttel ellenőriztük.
Kromoszómaszám-meghatározás
A sejttenyészetet egy napra 10%-os FCS-MEM tápoldatba helyeztük. A következő
napon 90 perces kolhicin-kezelést (0,5 g/ml; Sigma-Aldrich) végeztünk a sejtosztódás
leállítására. A sejteket tripszines kezeléssel (0,05 v/v % PBS-ben) az aljzatról
felszabadítottuk, és fugacsőbe helyeztük. Egy fugacsőbe 10 5 db sejt került 500 l 5%-os
FCS-MEM tápoldatban. A médiumhoz cseppenként 1 ml hipotóniás (0,56 %) kálium-
klorid (KCl) oldatot, majd 2x0,5 ml desztillált vizet adtunk. A hipotonizálás során
(összesen 10 perc) a sejteket 37 °C-on (5% CO2) inkubáltuk. Ezt követően a sejtes
oldatot 12 percig centrifugáltuk (1500 g). A sejt-csapadékhoz, cseppenként 4 ml frissen
készített, 4 °C-os ecetsav-metanol 1:3 elegyet (fixáló) adtunk, állandó enyhe rázás
mellett, majd 30 percig termosztátban tartottuk. A folyamatot (centrifugálás-fixálás-
szuszpendálás-inkubáció) háromszor megismételtük. Végül a sejteket 0,5 ml fixálóban
felvettük. Az oldatot zsírtalanított, száraz tárgylemezekre cseppentettük, cseppjeit
hagytuk szétfutni a lemezeken. Száradás után 4%-os Giemsa oldattal (Fluka, Sigma-
Aldrich) festettük (5 perc). A festett minta száradása után Depex-szel (Electron
Microscopy Sciences) fedtük le a lemezeket. A láthatóvá vált kromoszómákat
fénymikroszkópban számoltuk. A különböző sejttípusok kromoszómaszámának
eltéréseit statisztikai próbákkal ellenőriztük (variancia-analízis, Student-féle T-teszt).
Életképesség-mérés
A sejtkultúrák „életképességének” meghatározására MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-
2,5-diphenyl tetrazolium bromid) (Sigma-Aldrich) (Mosmann 1983) és AlamarBlue TM
(Biosource) (Ahmed 1994) redukciós tesztet alkalmaztunk.
Az MTT teszt előtt a vizsgált sejteket poli-L-lizinnel bevont 96-os tenyésztő edénybe
helyeztük 10 4 sejt/lyuk koncentrációban lyukanként 50 l 5%-os FCS-MEM
tápfolyadékba. Letapadás után 10 l MTT-t adtunk a tápfolyadékhoz és a tenyésztő
edényt 1 óráig 37°C-on, 5% CO2 mellett inkubáltuk. A kialakuló kék formazán
kristályokat a sejtekkel együtt 120 l savas izopropil-alkoholban (0,08 N) oldottuk fel.
39