dr. Zádori Anita - Semmelweis Egyetem Doktori Iskola

More documents

Recommendations

Info

Az AlamarBlue TM teszt előtt a vizsgált sejteket poli-L-lizinnel bevont 96-os tenyésztő edénybe helyeztük 10 4 sejt/lyuk koncentrációban 100 l 5%-os FCS-MEM tápfolyadékba. Latapadás után 10% (v/v) AlamarBlue TM reagenst adtunk a táphoz. A viabilitásra mindkét vizsgálat esetén a mért optikai denzitás (OD) értékekből következtettünk. Az OD-t mindkét eljárás esetében 540 vagy 570 nm teszt- és 600, 630 vagy 655 nm referencia-hullámhosszon mértük (Biorad Microplate Reader és Dynatech MR5000 készülék). A mérések 6-16 parallel lyukból történtek, legalább 4 független kísérletben. RT-PCR A GFP-4C és GFP-RC sejttenyészetekből Tri-Reagens (Sigma-Al<strong>dr</strong>ich) segítségével teljes RNS-mintát nyertünk és tisztítottunk ki. A genomiális DNS szennyeződést DNase-I kezeléssel (Fermentas) távolítottuk el. Az izolált RNS-t RNase/DNase-mentes vízben 0.3 mg/ml koncentrációban oldottuk fel és -70 °C-on tároltuk. Mintánként 3 g tisztított RNS-t felhasználva szintetizáltunk cDNS-t a “RevertAid TM First Strand cDNA Synthesis Kit” (Fermentas) segítségével. A neurogenin2 (ngn2), mash-1, math-2, nanog, sox2, blbp, GFAP, brachyury, hnf4, flk1, actin, hprt transzkriptumok specifikus szekvenciáinak kereséséhez a 2. táblázatban felsorolt primer párokat használtuk. A polimeráz láncreakciót Techne TC-512 géppel végeztük, Quiagen Hot Star Taq DNA- polimeráz használata mellett. A felszaporított termékeket etídium bromidot tartalmazó 1%-os agaróz gélen futtattuk és UV átvilágítással vizualizáltuk. 2. táblázat Az RT-PCR vizsgálathoz használt primer-párok Gének Primer-párok actin 5‟ agctgagagggaaatcgtgc 3‟ 5‟ gatggaggggccggactcat 3‟ blbp 5‟ aagacccgagttcctccagt 3‟ 5‟ atgccttttcataacagcga 3‟ brachyury 5‟ tccaggtgctatattgcc 3‟ 5‟ tgctgcctgtgagtcataac 3‟ flk1 (VGFR2) 5‟ cacctggcactctccaccttc 3‟ 5‟ gatttcatcccactaccgaaag 3‟ GFAP 5‟ gactatcgccgccaactgc 3‟ 5‟ cgtccttgtgctcctgcttc 3‟ hnf4 5‟ cttccttcttcatgccag 3‟ 5‟ acagtccccatctgaag 3‟ hprt 5‟ cacaggactagaacacctgc3‟ 5‟gctggtgaaaaggacctct3‟ math2 5‟tgagaatggcttgtccagaagg3‟ 5‟tggtagggtgggtagaatgtgg3‟ nanog 5‟ gcgcattttagcaccccaca 3‟ 5‟ gttctaagtcctaggtttgc 3‟ ngn2 5‟aagaggactatggcgtgtgg3‟ 5‟atgaagcaatcctccctcct3‟ sox2 5‟ gccctgcagtacaactccat 3‟ 5‟ acccctcccaattctcttgt 3‟ 40
B. Állatkísérletek Az állatkísérletek végzését az MTA KOKI Állatkísérleti Etikai Bizottsága jóváhagyásával, a Fővárosi Élelmiszer és Állategészségügyi Ellenőrző Állomás hivatalos engedélyének (2291/003/Főv/2006; érvényesség: 2011. december 7.) birtokában végeztük. Az állatok kezelése, műtét utáni gondozása megfelelt az Állatvédelmi Törvény előírásainak. Felhasznált állatfajok és törzsek Implantációs kísérleteinkben az MTA-KOKI és az Országos Pszichiátriai és Neurológiai Intézet állatállományából származó felnőtt NMRI, CD1, C57BL egereket, sejtizolációhoz az MTA-KOKI állatházából származó újszülött (P0-P2) CD1 és transzgenikus hGFAP-eGFP egereket használtunk. Altatás A műtét előtt a felnőtt egerek testsúlyát lemértük. A kb. 20-30 gramm testsúlyú egereket xylazin (25 mg/kg) és ketamin (125 mg/kg) intraperitoneális injekciójával altattuk el. Az altatás mélységét többször ellenőriztük, szükség esetén kisebb kiegészítő dózist alkalmaztunk az altatószerekből. Az újszülött állatokat zárt dobozban, szárazjégre helyezett papírvattára raktuk, és 2-4 perc elteltével műtöttük. Fagyasztásos lézió Az alvó állatokat sztereotaxiás készülékben (Stoelting Co., Lab Standard) rögzítettük. A fejbőrt a sutura sagittalis felett a középvonalban 1 cm hosszan felvágtuk, majd a koponyacsontot a tervezett beavatkozás helyének megfelelő ponton, egy 1,6 mm átmérőjű fúróval átlyukasztottuk. Agykérgi fagyasztásos sértés létrehozásához a kívánt agyi régió felett, a dura materhez egy rézből készült, fertőtlenített fagyasztórúd 1.4 mm átmérőjű, lapos felszínét érintettük hozzá (a középpont koordinátái: Br: -0.7 mm, L:2.3 mm). A készüléket porított szárazjég és aceton keverékével (-60 o C) hűtöttük le és tartottuk hidegen műtét alatt. A fémrúd 30 másodpercig maradt a kemény agyhártya felszínén. A beavatkozás után a területet óvatosan tisztítottuk, fertőtlenítettük, a bőrt zártuk. A bakteriális fertőzések megelőzése érdekében gentamycinnel (1μg/ml) átitatott papírvattával tisztítottuk meg a seb környékét. Az állatokat a műtét alatt és azt követően 41
Page 1 and 2: A környezet hatása embrionális n
Page 3 and 4: Eredmények .......................
Page 5 and 6: NG-2 - oligodendroglia prekurzor se
Page 7 and 8: technikájával bizonyították az
Page 9 and 10: 2. ábra Az őssejtek leszármazás
Page 11 and 12: 3. ábra A neuroepitheliális ősse
Page 13 and 14: A károsodás típusa Faj Detektál
Page 15 and 16: Céljukhoz, a szaglógumóhoz eljut
Page 17 and 18: A neurogén környezet jellemzői A
Page 19 and 20: sejtproliferáció-fokozódás mell
Page 21 and 22: agyi környezet módosítására, a
Page 23 and 24: A központi idegrendszeri kórálla
Page 25 and 26: módosításra, vagyis immortalizá
Page 27 and 28: Sejtimplantációt érintő problé
Page 29 and 30: mennyiségben voltak megtalálható
Page 31 and 32: Az idegi differenciálódás folyam
Page 33 and 34: Célkitűzések Munkám során azt
Page 35 and 36: kimetszettük. A kiemelt szövetet
Page 37 and 38: 11. ábra Primer egér asztrociták
Page 39: párhuzamos mérésből nyert adato
Page 43 and 44: sejtimplantációban nem részesül
Page 45 and 46: A kapott pontszámot minden csoport
Page 47 and 48: (6. táblázat). Amennyiben a máso
Page 49 and 50: Eredmények I. NE-4C sejtek „sors
Page 51 and 52: Ép állatokban - a korábbi kísé
Page 53 and 54: Hosszabb túlélés (5-8 hét) sor
Page 55 and 56: A 20. ábra A: A GFP-RC sejtklón t
Page 57 and 58: I.2 Az NE-4C sejtek kölcsönhatás
Page 59 and 60: fel az eltérő sejtek kezelésére
Page 61 and 62: I.2.3 A GL261 tumorsejtek és az NE
Page 63 and 64: Nem volt jele annak, hogy a tumorse
Page 65 and 66: II. In vitro előindukált GFP-4C s
Page 67 and 68: 12. táblázat Előindukált GFP-4C
Page 69 and 70: (34/ B ábra). Tehát a retinsavval
Page 71 and 72: A Nox Hipox HIF-1 34. ábra 48 ór
Page 73 and 74: TUNEL-pozitív sejtek aránya [%] A
Page 75 and 76: A Hoechst / III-tubulin B Normoxia
Page 77 and 78: expressziója a vizsgált időszakb
Page 79 and 80: III.2.1 Az implantált állatok vis
Page 81 and 82: (40/ A ábra). A lézionált terül
Page 83 and 84: A kisebb repopuláló saját- és b
Page 85 and 86: A Hoechst A’ ctx ctx B B’ C ctx
Page 87 and 88: Megbeszélés Teoretikusan a széle
Page 89 and 90: 16. táblázat Rövidítések: rev.
Page 91 and 92:
eakcióját vizsgáltuk. A hideglé
Page 93 and 94:
idegsejt-prekurzorok valószínűle
Page 95 and 96:
tumortól távolabbra (500-1000 m)
Page 97 and 98:
következtében szórványosan megf
Page 99 and 100:
Következtetések Munkánk során v
Page 101 and 102:
Összefoglalás Az NE-4C neuroektod
Page 103 and 104:
Irodalomjegyzék Aboody KS, Brown A
Page 105 and 106:
experimental brain tumors using neu
Page 107 and 108:
Curtis, M. A., Penney, E. B., Pears
Page 109 and 110:
Freundlieb N, François C, Tandé D
Page 111 and 112:
Hicks AU, Lappalainen RS, Narkilaht
Page 113 and 114:
Ke Y, Chi L, Xu R, Luo C, Gozal D,
Page 115 and 116:
Lim DA, Tramontin AD, Trevejo JM, H
Page 117 and 118:
Merkle FT, Tramontin AD, García-Ve
Page 119 and 120:
Pistollato F, Chen HL, Schwartz PH,
Page 121 and 122:
Schäbitz WR, Schade H, Heiland S,
Page 123 and 124:
injury in adult rats and its associ
Page 125 and 126:
Weinzierl MR, Laurer HL, Fuchs M, W
Page 127:
Köszönetnyilvánítás Köszönet
show all

dr. Zádori Anita - Semmelweis Egyetem Doktori Iskola

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?