Elektronika 2009-11.pdf - Instytut Systemów Elektronicznych

z pasty węglowej, zaś odniesienia (RE) - z pasty srebrnej,
chlorkowanej elektrochemicznie [26-29]. Pomiary wykonano
wykorzystując woltamperometrię cykliczną w zakresie potencjałów
-0,2...+1,0 V. Jako substrat używany był fosforan
kwasu askorbinowego - ze względu na wiele zalet, takich jak:
nietoksyczność, trwałość, dużą rozpuszczalność w roztworach
wodnych, niska cena i brak konieczności stosowania warunków
specjalnych, np. kontrolowanej atmosfery.
Woltamperogramy dla różnych stężeń IgG-AP oznaczanych
z wykorzystaniem czujnika sitodrukowanego z elektrodą
węglową oraz uśrednioną krzywą kalibracji od stężenia
IgG-AP, wyznaczoną dla kilku badanych czujników przedstawiono
na rys. 3. Stwierdzono, że dolna granica amperometrycznego
oznaczania IgG-AP za pomocą wytworzonych
w IBIB PAN węglowych czujników sitodrukowanych wynosiła
około 0,1 mg/l.
Inne specyficzne receptory stosowane
w bioczujnikach CRP
Oprócz przeciwciał w bioczujnikach CRP wykorzystywana
bywa interakcja między tym białkiem a fosfocholiną, która jest
jego klasycznym ligandem [30]. Przydatne okazało się też
białko A, które wykazuje powinowactwo i łączy się z regionem
F C przeciwciał IgG. Wykazano, że może ono być również
narzędziem do specyficznego wiązania białka
C-reaktywnego [31].
Zastosowanie znajdują też pojedyncze syntetyczne krótkie
nici DNA i RNA (oligonukleotydy), zwane aptamerami. W zależności
od rodzaju są one czułe na różne cząsteczki m.in. na
CRP. Bioczujniki bazujące na nich są nazywane aptasensorami
[30,32-34]. Receptory te są selekcjonowane in-vitro
z bibliotek kombinatoryjych techniką SELEX (Systematic Evolution
of Ligands by EXponential enrichment), opracowaną
niezależnie przez trzy laboratoria w 1990 roku [35]. Metoda
ta polega na inkubacji analitu z aptamerami, następnie wymywaniu
aptamerów niespecyficznych i powielaniu specyficznych
za pomocą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR).
Koszt i ryzyko ich wytwarzania są mniejsze niż w przypadku
przeciwciał, jednak progi detekcji w bioczujnikach na nich bazujących
są wyższe niż dla immunoczujników. Zaletą aptamerów
w odróżnieniu od przeciwciał jest ich odporność na
wyższe temperatury i możliwość całkowitej regeneracji po teście
- bez utraty właściwości [36]. Testy z udziałem aptamerów
ELONA - (Enzyme Linked Oligonucleotide Assay) przypominają
testy immunoenzymatyczne ELISA. Aptamery są stosowane
również razem z przeciwciałami w układach kanapkowych
[30,37].
Układy mikrofluidyczne
Układ mikroprzepływowy zapewnia zmniejszenie objętości
reagentów i próbek używanych podczas testu do pojedynczych
mikrolitrów, a duży stosunek powierzchni mikrokanalików
do ich objętości zwiększa intensywność reakcji przebiegających
w układzie. Wśród elektrochemicznych metod pomiaru,
amperometryczny układ detekcji jest najczęściej stosowanym
układem, ze względu na niski poziom szumów tła
i możliwość szybkiej detekcji.
Zastosowanie przeciwciał w immunoczujnikach pozwala
na uzyskanie dużej specyficzności testu - dzięki temu można
zmierzyć stężenie konkretnego analitu w złożonej próbce, takiej
jak np. krew.
Części systemów hybrydowych są wykonywane z różnych
materiałów takich jak: negatywowy fotorezyst SU-8
[38-40], poli(dimethylsiloxan) PDMS [41,42], szkło - np.
Pyrex, Foturan [43], krzem, poli(metylakrylan) PMMA [44,45],
poliwęglany PC, cykliczne olefinowe polimery i kopolimery
[46] oraz polistyren PS [47], Parylen [48] czy Kapton [49,50].
Często wykorzystane są materiały hybrydowe - np. PDMS
jest łączony ze szkłem [51-55]. Ze względu na prosty i mało
kosztowny sposób obróbki, wytwarzania i łączenia, a także
dużą biozgodność, dobre właściwości optyczne oraz dużą
odporność na czynniki chemiczne, najczęściej stosowanym
materiałem jest PDMS.
Układy mikrofluidyczne są często stosowane w układach
z immunoczujnikami m.in. z czujnikami do oznaczeń CRP
[31,32,56].
Immobilizacja receptorów
w bioczujnikach mikrofluidycznych
W immunoczujnikach mikrofluidycznych, immobilizacja receptorów
typu przeciwciała lub aptamery może być przeprowadzona
na elektrodach zintegrowanych z układem, ściankach
mikrokomór reaktorów (adsorpcja, pułapkowanie, wiązanie kowalencyjne)
lub na oddzielnych strukturach typu membrany
o chemicznie zmodyfikowanej rozwiniętej powierzchni wewnętrznej.
Przed immobilizacją za pomocą wiązań kowalencyjnych
jest na ogół przeprowadzana chemiczna modyfikacja
powierzchni w celu uzyskania hydrofilowych grup tiolowych lub
karboksylowych. Jako jednorazowe nośniki immunoreagentów
często są stosowane specjalne membrany o rozwiniętej i zmodyfikowanej
powierzchni, zawierającej grupy karboksylowe -
COOH. Takie rozwiązania są wykorzystywane do przygotowania
różnego typu membran np.: Pall Biodyne C, Pall Immunodyne
ABC, Millipore Affinity Membrane. Czasem stosowane
są również membrany do niespecyficznego wiązania białek
np. wykonane z: polifluorku winylidenu (PVDF), octanu celulozy
(CA) lub hybrydowa CA-PMMA [57].
W literaturze spotkać można wiele przykładów zastosowania
jako podłoży do unieruchamiania immunoreagentów
mikrokuleczek z tworzyw sztucznych np. polistyrenu [58] lub
szkła [59,60]. Mogą one działać w układach jednorazowych
lub przeznaczonych do regeneracji.
Moduł reakcyjny/pomiarowy w zależności od zastosowanych
materiałów może służyć do pomiarów jednorazowych
lub wielokrotnych. Przy użyciu wielokrotnym jego powierzchnia,
po przeprowadzonej reakcji, wymaga regeneracji. Roztwory
regeneracyjne: np. kwaśny roztwór glicyny [58,59],
kwaśny roztwór glicyny z dodatkiem 1% DMSO (pH 2,3) [60],
4 M roztwór mocznika, stężone HCl i NaOH, są roztworami
chemicznie aktywnymi, umożliwiającymi usuwanie kowalencyjnie
związanych immunokompleksów, co zapewnia przygotowanie
powierzchni do ponownej immobilizacji. Regeneracja
powierzchni immunoczujnika po pomiarze i powtórzenie procedur
na ogół nie zapewnia całkowitej powtarzalności wyników.
W wielu opisanych eksperymentach w okresach między
ELEKTRONIKA 11/2009 81