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congelamiento durante 20 min. a –70°C, y la fase etérea se trasvasó, se evaporó y
resuspendió en 1,4 ml de metanol agregándosele 0,6 ml de agua destilada. Se realizó
una nueva partición con n- hexano para lo cual se homogeneizó 2 min. y se descartó la
fase superior. Finalmente se agregó a la fase inferior, 2 ml de diclorometano y luego de
su homogeneización se descartó la fase superior acuosa dejándose evaporar la inferior.
Los residuos se resuspendieron en buffer RIA y fueron conservados a –20°C hasta
realizar las correspondientes mediciones.
Radioinmunoensayo (RIA)
En las mediciones de Progesterona, Testosterona y Estradiol, se utilizó un
antisuero provisto por el Laboratorio del Dr. Niswender (Animal Reproduction and
Biotechnology Laboratory, Colorado State University, Fort Collins, CO) en una
dilución apropiada para ligar el 37% del 3 H-esteroide utilizado como trazador (25 pg,
aproximadamente 10.000 cpm). Luego de la incubación de 16 hs a 4°C, se separó la
hormona libre de la unida al anticuerpo por medio del agregado de 0,2 ml de una
suspensión de carbón 0,5% y dextrano 0,05% en el buffer de ensayo: Na2HPO4 40mM,
NaH2PO4 39,5 mM, NaCl 155 mM, azida sódica 0,1% y gelatina 1% pH 7,0 (buffer
RIA) y posterior centrifugación. Los sobrenadantes completos fueron transferidos a
viales de conteo, a los que se les agregó 2ml de solución centellante. La radiactividad se
determinó en un contador de centelleo líquido Beckman LS 1801, con una eficiencia del
62%.
En el caso de las mediciones realizadas de androsterona, se utilizó un anticuerpo
provisto por el Dr. G. Barbe (Deparment of Physiology, University of Western Notario,
London, ON, Canada). El procedimiento del ensayo fue similar al descripto para la
medición de progesterona, siendo la solución de carbón utilizada en este caso del 0,05%
en el mismo buffer de ensayo y se utilizó de la misma un volumen de 2ml para cada
muestra. Bajo estas condiciones las variaciones intra- e inter-ensayo fueron de 8,0% y
14,2% para la progesterona; 7,2% y 12,5% para el estradiol; 7,3% y 13,2% para la
testosterona y 8,1% y 14,5% para la androsterona, respectivamente.
Extracción de ARN para la realización de RT-PCR
Para la realización de RT-PCR se procedió a extraer el ARN total de los folículos
aislados de los ovarios de los grupos control y LA (100 folículos por grupo) en los
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