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La reacción se llevó a cabo en una placa de 96 pocillos con las siguientes
condiciones: 2 min. a 50ºC, 10 min. a 95ºC, 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC
(desnaturalización) y 1 min. a 60ºC (apareamiento de primers y extensión). Se generó
una curva estándar de cinco concentraciones decrecientes (dilución 1/10) a partir de un
pool de ADNc de las distintas muestras para la cuantificación relativa del ARN
mensajero. Finalmente, los valores obtenidos para el ARN de nuestro gen blanco en cada
muestra se dividieron en los valores obtenidos para el 18S ARN en la misma muestra (el
mismo procedimiento se llevó a cabo con la curva estándar realizada).
Extracción de proteínas foliculares y realización de Western Blot
Los folículos aislados para la realización de los experimentos in vivo, así como
también los folículos sometidos a cultivo para los experimentos in vitro, se
homogenizaron en buffer de lisis (NP-40 1%, Tris 20 mM pH 8, NaCl 137 mM y
glicerol 10%) suplementado con inhibidores de proteasas (PMSF 0,5mM; ZPCK 0,025
mM; TLCK 0,025 mM; TPCK 0,025mM). El lisado se centrifugó a 4°C a 10.000 x g
durante 10 minutos y el pellet se descartó. La medición de proteínas en el sobrenadante
se realizó por el método de Bradford [321].
Para la detección de las distintas proteínas analizadas en este trabajo, se
sembraron 40-60 μg del extracto proteico de cada muestra en geles de poliacrilamida
(10%, 12% o 15%) con SDS (SDS-PAGE), luego de ser hervidas durante 5 minutos en
buffer (6% de SDS, 15% de β-mercaptoetanol, 60% glicerol, 0,006% azul bromofenol,
0,18M Tris-base, pH 6,8). Las proteínas se separaron por electroforesis a 25 mA durante
2 hs, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa en buffer Tris-base 0,025 M (pH
8,3), glicina 0,192 M, metanol 20% a 80V durante 2 hs a 4ºC. Los sitios de unión
remanentes sobre las membranas se bloquearon con una solución de TBS y detergente
tween (TTNBS 0,05%) y leche descremada en una concentración de 0,05g/ml durante 1
h a temperatura ambiente o incubando toda la noche. Luego las membranas fueron
incubadas con los correspondientes anticuerpos (StAR, 1:2000; CYP11A, 1:2500;
CYP17, 1:5000; VEGF, 1:100; ANGPT-1, 1:100; Flk-1, 1:100; Tie-2, 1:100; Caspasa-3,
1:500; PARP, 1:200, β-actina, 1:2000) durante toda la noche y luego de sucesivos
lavados con TTNBS, se incubaron las membranas con sus correspondientes anticuerpos
secundarios acoplados a la enzima peroxidasa (IgG de conejo acoplado a peroxidasa,
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