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Determinación de la actividad de caspasa-3
La actividad de la enzima caspasa-3 se determinó utilizando un ensayo
colorimétrico basado en la detección espectrofotométrica de un cromóforo: p-
nitroanilina (p-NA) el cual se produce por clivaje del sustrato de la caspasa-3 marcado
DEVD-pNA. Los folículos fueron homogeneizados en buffer de lisis (50mM HEPES,
pH 7,4; 100 mM NaCl; 0,1% CHAPS; 1mM DTT; 1 mM EDTA) con el agregado de
inhibidores de proteasas (PMSF, SIGMA). El lisado fue centrifugado y la concentración
de proteínas se determinó en el sobrenadante por el ensayo de Bradford [321]. La
reacción enzimática se llevó a cabo en el buffer de ensayo (50mM HEPES, pH 7,4; 100
mM NaCl; 0,1% CHAPS; 10 mM DTT; 0,1 mM EDTA; 10% glicerol) conteniendo 50
µg de proteína y 200 µM DEVD-pNA. Cada muestra se dividió en tres partes: una
contenía el inhibidor de la enzima Ac-DEVD-CHO 100 nM con sustrato y extracto
proteico y dos partes contenían el sustrato y el extracto sin inhibidor. La mezcla de
reacción se incubó a 37ºC durante 3 hs y se procedió a la lectura de la absorbancia cada
10 minutos. El valor del blanco de reacción (ausencia de extracto) fue sustraído de todas
las muestras. Siguiendo las instrucciones del ensayo, los resultados fueron
seleccionados luego de 90 minutos de reacción, tiempo a partir del cual los valores del
blanco y de la muestra que poseía el inhibidor de la enzima no variaron a lo largo del
tiempo.
Análisis de datos
Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces y se utilizaron cinco
animales por grupo experimental en cada repetición. Las incubaciones en los
experimentos in vitro, se realizaron utilizando tres pooles de folículos provenientes de
distintos animales para cada condición de incubación. En las determinaciones de
esteroides séricos, la cantidad de animales utilizados fue detallada en cada caso entre
paréntesis en la correspondiente tabla en la sección de resultados. Para la semi-
cuantificación de la expresión de la caspasa-3 por inmunohistoquimica, se analizaron 5
campos seleccionados al azar en cada sección de ovario. Se estudio un total de seis
secciones/ovario y cinco fueron los ovarios analizados.
Los resultados se expresaron utilizando la media o promedio±error estándar
(SEM) de los resultados obtenidos en los tres experimentos (n=3). Los geles mostrados
fueron obtenidos de experimentos representativos. El análisis estadístico utilizado fue el
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