el documento - Biblioteca Digital FCEN UBA - Universidad de ...

distintos períodos de tiempos a estudiar. Siguiendo las instrucciones del reactivo
TRIZOL ® (GIBCO-BRL, Grand Island, NY), se procedió de la siguiente manera: los
folículos fueron homogeneizados en TRIZOL ® (1ml/50-100 mg de tejido), incubados a
temperatura ambiente durante 5 minutos y se les agregó 0,2 ml de cloroformo/ml de
TRIZOL ® . Luego de agitar vigorosamente e incubar a temperatura ambiente, se
centrifugó a 12.000 xg durante 20-30 minutos a 4°C. A la fase acuosa obtenida se le
agregó 0,6ml de alcohol isopropílico, se incubó a -20°C y se centrifugó a 12.000 xg
durante 20-30 minutos a 4°C. Se descartó el sobrenadante y el pellet se lavó con etanol
75%. Luego de centrifugar a 12.000 xg durante 5-10 minutos, se dejó secar el pellet
durante 1-2 minutos. El mismo se resuspendió en 30 μl de agua libre de RNAsas y se
calculó la concentración de ARN en el espectrofotómetro midiendo absorbancia a 260 y
280 nm.
Se utilizaron 2,5µg del ARN total obtenido durante la extracción de los diferentes
grupos y tratamientos para la transcripción reversa a ADNc. Luego de tratar al ARN con
la enzima DNAsa, se realizó la transcripción utilizando la enzima transcriptasa reversa
(Moloney murine leucemia virus (Promega, Madison, WI)) y oligonucleótidos como
primers (Biodynamics) durante 1h a 37°C en un volumen de reacción de 20µl.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Las reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando los pares de primers
descriptos en la tabla 1 en un volumen final de reacción de 50µl. La mezcla de reacción
consistió en primers en una concentración de 1 nM de cada oligo, 200 mM de la mezcla
de deoxy-nucleótidos trifosfato incluyendo: [ 32 P]-dCTP (3000 Ci/mmol), 20 U de la
enzima RNasin, y 2.5 U Taq-DNA polimerasa in buffer de PCR (Promega, Madison,
WI). La reacción de PCR consistió en la desnaturalización a 94°C durante 1,5 minutos,
apareamiento a 60°C durante 30 segundos, un paso de extensión a 72°C durante 2
minutos y una extensión final de 5 minutos a 72°C. El número de ciclos utilizados para
cada gen fue optimizado hasta llegar a la fase exponencial de amplificación. Tanto el
número de ciclos como los primers utilizados en cada caso están detallados en la tabla.
Los productos se visualizaron utilizando geles de agarosa 1,7% teñidos con bromuro de
etidio durante 15 min. para aumentar la sensibilidad. Luego se visualizaron en un
transiluminador de luz ultravioleta y se tomaron radiografías. Las bandas fueron
88