el documento - Biblioteca Digital FCEN UBA - Universidad de ...

1:1000 y IgG de cabra acoplado a peroxidasa, 1:1000 diluído en Tween 20 0,1%)
durante 1 h a temperatura ambiente. Finalmente las membranas fueron incubadas con el
reactivo de quimioluminiscencia (Amersham Pharmacia) durante 1 minuto. El
contenido proteico se analizó en las distintas muestras mediante la realización de
densitometría de las bandas obtenidas para la proteína de interés. La densidad de cada
muestra se normalizó con la densidad de la banda obtenida para la proteína β-actina en
la misma muestra. En su defecto, se utilizó una banda detectada en el patrón del rojo
Ponceau que no posee variación frente a los distintos tratamientos. Los datos de la
densidad óptica se expresaron como unidades arbitrarias±SEM (n=3).
Técnica de Inmunohistoquímica
Los ovarios fueron extraídos de los animales perteneciente a los distintos tratamientos y
fijados en formalina 4% durante 12 hs, tras los cual se incluyeron en parafina. Los
cortes del taco de parafina fueron realizados cada 50-μm con un grosor de 3 micrones
cada una y montadas en portaobjetos. De esta forma se evitó contar al mismo folículo
dos veces acorde a los descripto por Woodruff et al [322].
La secciones de tejido se desparafinaron en xileno y se rehidrataron realizando
lavados con alcoholes con graduación decrecientes (100%-75%). La actividad de la
enzima peroxidasa endógena se bloqueó con peróxido de hidrógeno en buffer PBS y la
unión no especifica a otros epitopes se bloqueó incubando las secciones con BSA 2%
(seroalbúmina bovina) durante 20 minutos. Luego las secciones se incubaron con los
anticuerpos anti-StAR (1:2000), el anticuerpo anti-caspasa-3 (1:100) durante toda la
noche a 4ºC. Al otro día, luego de lavados sucesivos con PBS las secciones fueron
incubadas con el anticuerpo secundario IgG anti-conejo biotinilado durante 1 h y luego
durante 30 minutos con el complejo ABC: avidina-peroxidasa biotinilada (Vectastain
ABC system, Vector Laboratories, Burlingame, CA). La marca positiva fue visualizada
con el sustrato de la enzima peroxidasa, diaminobencidina (DAB) en buffer de revelado
(Roche, Diagnostics, Germany). La reacción se detuvo con agua destilada, las secciones
se tiñeron con hematoxilina durante 1 minuto y se procedió a la deshidratación
previamente a realizar el montaje con el medio apropiado (PMYR, Buenos Aires,
Argentina).
91