N 33 V 72 Final

TENORIO-SALGADO, S.; DOMÍNGUEZ-GARCÍA, D. Y LIZAMA-UC, G.
Material biológico
MATERIAL Y MÉTODOS
Los gránulos del consorcio microbiano empleados en este
estudio fueron recolectados en el municipio de Escárcega, los
cuales fueron almacenados en glicerol al 60% en el ultra
congelador hasta su uso.
Medio de cultivo para el aislamiento de bacterias
El aislamiento de bacterias que conforman el consorcio
microbiano se realizó mediante la disgregación de los
gránulos con el gentleMACS Dissociator, posteriormente se
hicieron diluciones seriales y se plaqueó en medio de cultivo
MRS por 48 horas para obtener colonias aisladas.
Ensayos de antagonismo
Discos micelios de ocho milímetros incubados durante de
seis días, fueron colocados en el centro de las placas de Petri,
1 μl de cultivo liquido bacteriano es inoculado en uno de los
cuadrantes de la placa Petri (cuatro bacterias por placa, una
en cada cuadrante), y las placas se incubaron a 28 ° C por seis
días. A partir de entonces, las zonas de inhibición (en mm) se
determinaron midiendo la distancia entre los bordes del
micelio fúngico y la cepa bacteriana. Todas las cepas fueron
evaluadas en dos réplicas independientes. El efecto
antagonista bacteriano contra los hongos se calculó en
función de la inhibición radial porcentajes, de acuerdo con la
siguiente ecuación:
Los productos fueron fraccionados mediante electroforesis
en geles de agarosa al 2% y teñidos con bromuro de etidio 10
mg.mL -1 .
Tabla 1. Secuencia de cebadores usadas en la amplificación por PCR
Cebador Secuencia (5´- 3´) T.A Ref.
Oligo48
Oligo 105
EntF
EntR
plnF
plnR
TAYGGIAAYGGIGTITAYTG
CYTCDATNGCRTTRTC
GGGTACCACTCATAGTGGAA
CCAGCAGTTCTTCCAATTTCA
GGCATAGTTAAAATTCCCCCC
CAGGTTGCCGCAAAAAAAG
3 Kb 1
412 pb 2
428 pb 3
T.A. =Tamaño del amplicón. Ref. = Referencias 1) Losteinkit et al. (2001),
2) Suwanjinda et al. (2007), 3) Rojo-Bezares et al. (2007)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los plásmidos son moléculas de ADN que se auto replican y
no están asociados al cromosoma o ADN nuclear, estos no
son material genético para la supervivencia de la bacteria, sin
embargo, pueden acarrear genes de interés. Un gran número
de plásmidos han sido aislados y caracterizados a partir de
bacterias acido lácticas como material genético
extracromosomal (Gasson 1990). En el presente trabajo se
aislaron 14 bacterias de un consorcio microbiano tipo kéfir
proveniente de Escárcega Campeche, a las cuales se les
realizó ensayos de antagonismo sobre hongos fitopatógenos
(figura 1).
% radial de inhibición= ( Rc−Ri
Rc ) 100
donde Rc es el radio del hongo control que se encontrara en
ausencia de la bacteria y Ri representa el radio del hongo en
presencia de la bacteria antagonista (Ezziyyani et al. 2004)
Aislamiento de plásmidos
Cultivo fresco de bacterias aisladas y crecidas en medio MRS
por 24 horas a 37ºC y 250 rpm, fueron empleadas para el
aislamiento de los plásmidos siguiendo el protocolo
establecido de GeneJET Plasmid Miniprep Kit de la casa
comercial Thermo Fisher. Los productos del aislamiento
fueron corroborados en geles de agarosa al 2% y teñidos con
bromuro de etidio 10 mg.mL -1
Detección de bacteriocinas por PCR
Para la detección de bacteriocinas se emplearon tres juegos
de cebadores los cuales se presentan en la tabla 1, las
condiciones de la PCR fueron: 94ºC por 5 min, 30 ciclos de
94ºC por 1 min, 51ºC por 40 s, 72ºC por 3 min y una
extensión final a 72ºC por 10 min.
Figura. 1. Efecto Antagonista de las bacterias frente hongos fitopatógenos
Los análisis de antagonismo demostraron que estas cepas
presentan actividad antagónica entre el 50 y 90%
dependiendo del tipo de microorganismo sobre el cual
actúan. A fin de detectar si estas cepas contenían ADN
extracromosomal, se realizó una extracción plasmídica. En la
figura 2 se presenta el ADN plasmídico proveniente de estas
cepas, de las 12 cepas analizadas, las cepas 1,8,12 no
REVISTA DEL CENTRO DE GRADUADOS E INVESTIGACIÓN. INSTITUTO TECNOLÓGICO MÉRIDA Vol. 33 NÚM. 72 127