Sabato 27 ottobre 2012 - Pacini Editore

RElaziONi
piego della tecnica FISH (Fluorescence in situ hybridization)
con sonde Break Apart. Dalle metodiche descritte, emerge
l’importanza della qualità e dell’attendibilità del dato molecolare.
Queste due caratteristiche sono fondamentali in un
contesto di efficienza che tenga conto anche della tempistica
con la quale il dato molecolare viene trasmesso al medico
oncologo richiedente. A tal proposito, molto spesso, risulta
utile e preziosa anche la collaborazione anche tra i Servizi
di Anatomia Patologica quando il campione istologico da
analizzare è all’esterno del laboratorio che effettuerà l’analisi
molecolare. Dell’ottimizzazione di questo tipo di interazione
ne beneficia l’oncologo che richiede il test, anche lavorando
in una struttura a distanza, ma soprattutto il paziente che può
ricevere il risultato dell’analisi molecolare senza spostarsi.
A “regolamentare” questa materia, grazie ai documenti sulle
“raccomandazioni” per la corretta esecuzione dei test sopra
descritti, sono i gruppi di studio della SIAPEC ed i controlli di
qualità promossi da SIAPEC ed AIOM. Grazie alle due Società
Scientifiche esistono dei programmi di qualità nazionali che
permettono ai centri partecipanti di potersi validare. Questo è
un enorme valore aggiunto sia per la tutela del paziente che
per l’attendibilità del dato molecolare inteso come prodotto
finale di una sommatoria di fattori. Le tecniche di diagnostica
molecolare in Anatomia Patologica oggi sono una realtà
imprescindibile nella pratica oncologica ed aprono intressanti
prospettive al altri target molecolari che attualmente sono in
corso di validazione. L’esigenza è quella di avere sempre più
informazioni relative allo stato mutazionale dei geni implicati
nelle patologie oncologiche. L’evoluzione delle tecnologie
biomediche vede la possibilità di eseguire sequenziamenti su
piattaforme di nuova generazione (Next-Generation Sequencing).
Questo tipo sviluppo tecnologico ha portato anche una
diminuizone dei costi e dei tempi per l’esecuzione dei test.
L’appropriato utilizzo di queste tecnologie richiede specifiche
competenze professionali ed una collaborazione sempre maggiore
tra le figure interdisciplinari coinvolte. Concludendo, si
può certamente affermare che stiamo assistendo ad un “balzo
evoluzionistico” della diagnostica molecolare all’interno dei
Servizi di Anatomia Patologica. Tuttò ciò sarà un valore aggiunto
per diagnosi del paziente, sempre più ricca di informazioni,
solo se si terrà presente lo storico bagaglio della cultura
anatomopatologica. Senza questa cultura, che contestualizza
le informazioni, tutti i dati molecolari ricavati dalle moderne
tecnologie non si tradurrebbero in potenziali target terapeutici,
ma bensì in dati di laboratorio del tutto aspecifici.
Il campione citologico nella diagnostica
molecolare
A. Iaccarino
Dipartimento di Scienze Biomorfologiche e Funzionali, Università di
Napoli Federico II, Napoli
In an increased number of settings, cytology represents the
only source of sampling and it often substitutes histology as
an independent diagnostic modality. Thus, DNA molecular
targets to stratify patients for targeted therapy are often evaluated
on cytology. This talk discusses the applications and
limitations of DNA mutational testing on cytology. Respect to
histology, most cytological samples have the advantages of a
purer population of tumor cells, with low stromal component,
a better preserved DNA and of assessing at the same time of
sample collection cellular adequacy for DNA testing. Any
cytological slide is fixed within seconds of being obtained,
whereas surgical tissues may frequently be maintained at
261
room temperature for lengthy periods before being processed
and fixed. Because 5 μm tissue sections usually divide nuclei,
most sectioned nuclei on a histology slide will contain
only a portion of the genome. In comparison, each nucleus
is preserved intact in most cytological preparations, so fewer
cells are required for similar quantities of DNA. The cellular
composition and in particular the ratio between normal and
neoplastic cells is dependent on the source of the cytological
specimen. Differences exists between exfoliative and aspirative
cytological specimens. Effusions, brushings and washings
frequently contain numerous non-lesional cells, making the
selective isolation of neoplastic cells difficult. FNA ensures
a more selective sampling; a single FNA pass yields up to 1
million of neoplastic cells 1 , with a minimal stromal contamination
2 . Symmans et al, who evaluated neoplastic and stromal
cell components in paired FNA and breast core needle biopsy
(CBX), showed that the FNA samples contained more tumor
cells (80% vs. 50%) and fewer stromal cells (5% vs. 30%)
than the CBX samples 2 . In such a pure population of tumor
cells with intact nuclei, a gene mutation can be detected even
from the extremely small specimens, as those that in routine
may residue after extensive diagnostic workup with special
stains. In fact, a very low amount (0.5–2 mm 2 ) cell block 3 or a needle rinse
may be sufficient for mutation detection 4-6
To fully exploit the potential of the cytological sample, beside
high standard cellular morphology, care should also be taken
to preserve DNA quality within the sample 7 . Alcohol-based
fixatives are significantly better than formalin; this latter reduces
the quality of extracted nucleic acids by causing wide
spread cross-linkage between nucleic acids and proteins,
limiting the length of the DNA fragments that can be successfully
amplified and increasing the number of cells required for
accurate testing. Conversely, fixative solutions used in liquidbased
cytology do not have the same problems with DNA
degradation that is seen in formalin-fixed paraffin embedded
tissue. Since preservative solution have been designed for optimal
preservation of nucleic acids, the DNA extracted from
liquid-based cytology (LBC) samples has higher yield, longterm
stability, optimal 260/280 ratios and fragments not less
than 400 bp.. The stability of PreservCyt (Cytyc Corporation,
Boxborough, MA), a methanol-based medium used in liquid
cytology is high and sample can be stored for 4-5 years before
the specimens accrue significant losses in DNA integrity as
detected by PCR 8 .
Besides fixation effects the type of cytological biospecimen
from which DNA is extracted also matters. Sample collection
and processing may greatly differ leading to many different
cytopreparation types. Direct smears, CBs and monolayer
preparations 2 have advantages and drawbacks in mutational
assays. Owing to the high quality of nucleic acids that can be
extracted and the ease of immediate assessment for specimen
adequacy, direct smears have extensively been exploited for
BRAF 9-10 and EGFR testing 11-12 ; in most of studies the design
was retrospective and the results obtained on either Diff-Quik
or Papanicolaou direct smears were compared to those obtained
on matched histological samples. Also CBs were employed
for mutational testing As a general rule, direct smears
are a more robust and valuable DNA source than matched cell
blocks. and Diff-Quik stained smears yield a better preserved
DNA than the Papanicolaou ones 13 .
A cytopathologist’s onsite evaluation of the harvested material,
confirming the presence of a sizeable number of neoplastic
cells, may be crucial. However, in a busy pathology department
it may not be possible to provide a cytology team for the