virus del papiloma humano y cáncer: epidemiología y prevención ...

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MUESTRA FRESCA MEDIO DE TRANSPORTE/ CONSERVANTE PCR: Reacción en cadena de la polimerasa. RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism AR: Alto riesgo BR: Bajo riesgo hC2: test de la captura de híbridos 2 RECOGIDA DE MUESTRAS • Células del cuello uterino • Células de la vagina/vulva • Células de la mucosa anal • Células de la mucosa uretral (pene) • Otras • Biopsias TEST DE CAPTURA DE HÍBRIDOS (hC2, DIGENE) SONDAS DE ALTO RIESGO (AR) TRANSPORTE MÉTODOS MOLECULARES DE DETECCIÓN DEL VPH 91 Determinación de VPH: aspectos técnicos • Specimen Transport Medium (Digene Corporation) • ThinPrep® Pap Test (Cytyc Corporation) • PreservCyt® Solution (Cytyc Corporation) MÉTODO DE AMPLIFICACIÓN DE SEÑAL Lisis y desnaturalización de células Positivo/Negativo AR Positivo/Negativo AR y BR SONDAS DE BAJO RIESGO (BR) Positivo/Negativo BR AMPLIO ESPECTRO (Múltiples tipos de VPH/PCR) MUESTRA EN PARAFINA • Biopsia CORTES HISTOLÓGICOS (5 cortes de 5 µm.) MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN DE SECUENCIAS DIANA Extracción de ácidos nucleicos AMPLIFICACIÓN POR PCR • RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism • Secuenciación • Hibridación • Hibridación inversa • Métodos comerciales • Métodos de diseño propio • Métodos comerciales • Métodos de diseño propio ESPECÍFICA DE TIPO (Un tipo de VPH/PCR) Detección de VPH Detección de VPH y Tipado Tipado Figura 5.1 Algoritmo de diagnóstico y caracterización del VPH mediante métodos moleculares.
Marta Ortiz Rivera, Montserrat Torres Hortal, Alfredo García Sáiz Roche Applied Science, Suiza, etc.). El método de extracción de ácidos nucleicos es un punto crítico, ya que un bajo rendimiento del método utilizado puede disminuir significativamente la sensibilidad de las técnicas moleculares, tanto desde el punto de vista de la detección del VPH como del análisis de infecciones por múltiples tipos del VPH. La comparación de los diferentes métodos de extracción aplicados al diagnóstico del VPH es compleja debido a la variedad de protocolos y de sistemas de amplificación descritos en la bibliografía. La utilización de controles internos en las reacciones de amplificación, como la detección de genes constitutivos (ß-globina, ß-actina) para evaluar la calidad del ácido nucleico extraído, constituye una herramienta de gran utilidad. La utilización de muestras de archivo, generalmente tejidos incluidos en parafina, es importante para la realización de estudios retrospectivos. Sin embargo, el proceso de fijación puede afectar considerablemente a la calidad de los ácidos nucleicos. Este tipo de muestras es adecuado para sistemas basados en la amplificación de pequeños fragmentos de ADN. 5.2.2. Métodos de amplificación de señal El único sistema basado en esta tecnología para la detección del VPH es el test de captura de híbridos, comercializado por la empresa Digene Corporation, utilizando la metodología Hybrid Capture® (hc). Esta prueba en la actualidad está disponible en dos formatos. El formato hc2 HPV DNA Test incluye dos mezclas de sondas, una para la detección de 13 tipos de VPHs de alto riesgo (VPHs 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68) y otra para la detección de 5 tipos de bajo riesgo (VPHs 6, 11, 42, 43, 44). El ensayo puede realizarse con la sonda de bajo riesgo y/o de alto riesgo. Por su parte, el formato hc2 High Risk DNA Test incluye sólo la mezcla de sondas para la detección de los 13 tipos de VPHs de alto riesgo. Esta metodología fue aprobada por la Food and Drug Administration (FDA) de los Estados Unidos en el año 2003. La Figura 5.2 muestra de forma esquemática el principio de la técnica, que incluye los siguientes pasos: • Desnaturalización de las muestras biológicas con el ADN diana. • Hibridación con mezclas de sondas ARN, dando lugar a la formación de híbridos de ARN-ADN. • Estos híbridos son capturados por anticuerpos universales que están unidos a la fase sólida. • Los híbridos inmovilizados reaccionan con anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina, específicos para los híbridos de ADN-ARN. 92
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